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Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten. Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,020 bis 1,025. Bewahren Sie alle Glas-und Kunststoffprodukte getrennt von dem übrigen Laborgeräte, um eine Kontamination mit Chemikalien zu vermeiden. Embryo Grade Laborgeräte sauber durch Spülen mit VE-Wasser oder gelegentliche Einweichen in verdünnter Natriumhypochlorit gefolgt von Spülen mehrmals in Wasser. 1. Gewinnung und Reifung Gameten aus Patiria miniata Erwachsene <ol><li> Wählen Sie ein Tier Gonaden herauszuschneiden. Bestimmen Sex nach der Exzision durch die Suche nach der Gegenwart der Eierstöcke oder Hoden, weil P. miniata sind nicht an sichxually dimorphic. </li><li> Schneiden eine kleine Öffnung, die nicht größer als 1 cm, entlang der Seite von einem Seestern Arm mit einer Skalpellklinge (1A). Mit Hilfe von kleinen stumpfen Enden Zange das Zurückziehen der Schnittkanten der Gonaden Gewebe für den Zugriff auf und ziehen Gonaden Gewebe durch den Einschnitt. HINWEIS: Vermeiden Sie es, aus Darmgewebe, die eine lose grau oder braun Gewebe (Abbildung 1B) ist. Eierstöcke sind in der Regel orange, gelb oder hellbraun (1C), während die Hoden sind weiß oder beige und wenn gestört wird dazu führen, Meerwasser milchig oder trüb, im Aussehen (Abbildung 1D) zu werden. </li><li> Zurück zu den Frauen Aquarien. Isolieren Männchen um ein oder zwei Stunden in einen Behälter mit SW seit dem Stress aus Laich Handhabung kann zu induzieren. Tiere heilen entlang der Einschnittstelle und weiter zu Gameten für mehrere Monate zur Verfügung stellen. </li><li> Sammeln Hoden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit so wenig wie möglich und SW Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Bewahren Sie die Hoden nicht wired am Tag der Entnahme bei 4 ° C für bis zu einer Woche. </li><li> Sammeln Eierstöcke in einem kleinen Glas Kulturschale in einem mehrere Milliliter SW. Um die Eizellen aus dem Eierstock Gewebe freizugeben, necken neben das Gewebe mit zwei Pinzetten, bis keine großen Stücke bleiben. HINWEIS: Optimal ist die Mehrheit der Oozyten voll entwickelt. Solche Eizellen sind groß, rund und klar, gelb oder hellbraun mit einem deutlichen Keimbläschen in der Eizelle (2A), im Vergleich zu der Untergruppe der nicht entwickelten Eizellen, die kleiner, braun, körnig und opak (2B) sind. Wenn mehr als rund 25% der Eizellen sind von unentwickelten Vielfalt, wählen Sie eine andere weibliche Eizellen zu erhalten. </li><li> Gießen Sie die Eizellen und verbleibende Gewebe durch ein Sieb mit einer Filtertasse 200 um Porengröße und sammeln durch fließen. Dadurch werden alle Sorten von Eizellen enthalten, aber Eierstockgewebe zu entfernen. Verdrängen verbleibenden Oozyten aus dem Gewebe durch das Filter gefangen durch Sprühen wit SW aus einer Spritzflasche. Filtertassen werden mit einem 50 ml konischen Röhrchen (3A-A &#39;) hergestellt. </li><li> Gießen Sie die Strömung durch aus Schritt 1.6 durch ein 100 um Maschenfiltertasse. Verwerfen kleinen Eizellen bei der Durchströmung. Große voll entwickelten Eizellen, die bereit für die Reifung wird auf dem Filter zu bleiben. Spülen Sie die Oozyten in einen sauberen 200-ml-Becher. </li><li> Fügen Sie 95 ml SW auf den 200 ml-Becherglas von Eizellen. 5 ml von 200 uM 1-Methyladenin zu einer Endkonzentration von 10 uM. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen zu einem großen flachen Kulturschale und Ort bei 15 ° C. Eine hohe Oberfläche zu Volumen Kulturschale ermöglicht den Sauerstoffaustausch. Die Eizellen reifen nicht oder nicht gut entwickeln, wenn sie in dieser Reifephase überfüllt sind. Aufgeteilt in mehrere Gerichte der SW plus 10 uM 1-methlyadenine bis Kultur ist weniger als 200 Eizellen / ml. </li><li> Lassen Sie die Oozyten für 45-90 min reifen, aber nicht mehr, da dies die Eizellen nicht in der Lage zu sein, machen fertilized. Um festzustellen, ob die Reifung abgeschlossen ist, bei der Eizellen schauen unter einem Binokular. Die Keimbläschen bewegt sich auf und verschmilzt mit der Zellmembran während der Reifung. Es bricht dann nach unten und ist nicht mehr in reifen Oozyten (Abbildung 2C) sichtbar daher. </li></ol> 2. Die Befruchtung der Eizellen Ältere <ol><li> Wählte eine kleine Gruppe von Hodengewebe, etwa erbsengroße und Hackfleisch in einem kleinen Glas Kulturschale mit etwa 1 ml SW. </li><li> Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette auf 2-3 Tropfen der resultierende milchige Meerwasser auf etwa 100 ml der reifen Eizellen übertragen und wirbeln die Kulturschale zu mischen. Vermeiden Sie die Übertragung Stücke von Hodengewebe. Vermeiden Sie es größere Mengen an Spermien, da dies zu Polyspermie und anschließende schlechten Entwicklung führen. </li><li> Nach einigen Minuten beobachten die Eizellen unter einem Binokular. Befruchtete Eier oder Zygoten, eine Befruchtung Umschlag, der eine klare Blase, die aus dem cel erhebt, istl Membran (2D). HINWEIS: Nicht mit der Kultur vor, wenn weniger als etwa 90% der Eier zu befruchten, da schlechte Befruchtungsraten sind ein Hinweis auf eine ungesunde Kultur, die auch nicht gut entwickeln kann. </li><li> Nach der vollständigen Befruchtung ist, ändern Sie die SW auf den Zygoten von Gießen durch einen 100 um Sieb-Filter und Spülen in eine Kulturschale mit frischem SW. Es ist wichtig, die überschüssige Spermien Sauerstoffmangel zu verhindern entfernen. Legen Sie die Kulturschale bei 15 ° C für 15-30 min. </li></ol> 3. De-Geliermittel und Rudern befruchteten Eier <ol><li> Vorbereitung Injektion Gerichte, indem Sie den Deckel von einem 60 x 15 mm Petrischale aus Polystyrol. <ol><li> Zeichnen Sie einen Permanent-Marker Stiftlinie auf der Rückseite der Schale, um den Bereich, den Bereich der Blick auf die Mikroinjektion Mikroskop passt. Dies stellt sicher, dass alle gerudert Embryonen im Mikroskop Feld. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Pasteur-Pipette, um eine Linie durch den Kreis, S. punktenreferably zu einer Seite des Kreises (3B). Verwenden Sie diese Linie später Injektionsnadeln (Schritt 4.5) zu brechen. HINWEIS: Reagenzien häufig verwendet, um Seeigel-Embryonen, zB Protaminsulfat oder Poly-L Lysin, sind unnötig halten. De-Sülze P. miniata Zygoten haften sehr gut auf unbeschichteten Kunststoff. Beachten Sie, dass sie nicht gut zu Glasschalen bleiben. </li></ol></li><li> Fügen etwa 10 ml SW zu jeder Schale, so daß die Oberfläche bedeckt, aber das Wasser wird nicht zu spritzen in die Schale, da dies reihig Embryonen stören. </li><li> Entfernen Sie die P. miniata Zygote Gallerthülle mit Säure SW vor Rudern. Diese Gallerthülle ist umfangreicher als die für Modell Seeigel-Arten beobachtet. <ol><li> Bereiten Säure SW im Bereich von pH 4,0 bis 4,2. Der pH-Wert ist entscheidend für die effiziente Entfernung von Gallerthülle, gestattet jedoch eine normale Entwicklung. </li><li> Fügen Sie einzelne Tropfen von 1 N (1 M) HCl in SW zu einem 1 L Lager von SW. Lassen Sie jeder Tropfen vollständig mischenund zu überwachen, bevor Sie mehr pH-HCl. HINWEIS: Ein bis mehr ml HCl ergibt die entsprechenden pH-Wert, aber nicht das gesamte Volumen auf einmal hinzuzufügen. HINWEIS: Bereiten 1 N HCl in Abzug mit SW-und 12 N (12 M) HCl. </li><li> Entfernen SW auf Zygoten durch Gießen Sie sie auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie in einen 200-ml-Becher in die kleinste Menge von SW möglich (ca. 10 ml). Das Becherglas wird bis zu 150 ml mit Säure SW (pH 4,0) und damit die Zygoten in die Säure SW 3 min stehen. </li></ol></li><li> Streifen Gallerthülle von den Zygoten von ihnen Gießen hin und her zwischen zwei 200 ml-Becher, jedes Mal vorbei an den Zygoten durch ein 200 um Sieb-Filter. Gießen Sie die Zygoten durch den Filter um 5-10x über ca. 2 min Zeitfenster. </li><li> Säure zu entfernen, indem die SW Zygoten auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie die Zygoten in eine kleine Glasschale mit Kultur SW. De-Sülze Zygoten können Kunststoffschalen bleiben. Reihe Embryonen sofort; sie beginnen, mehr zu produzieren jElly Mantel, die schlechte Haftung der Zeit führt zu Kunststoffschalen. </li><li> Verwenden Sie einen Mund Pipette (3C-C &#39;) von der Kulturschale Glas abholen Zygoten und legen Sie sie in geraden Linien auf den Einspritz Gerichte. Schmelzen Sie die Mitte der dünnen Seite einer Pasteur-Pipette über einer Flamme, bis das Glas weich ist. Schnell ziehen Sie die Enden der Glas auseinander, um eine sehr dünne Strecke von Glas zu produzieren. Sobald das Glas abgekühlt ist, brechen Sie das kleine Ende des Pasteur-Pipette (für weitere Informationen auf die Vorbereitung ein Mund Pipette sehen Wessel et al., 2004 17 oder Süß et al., 2004 18). <ol><li> Machen Sie ein Ruder Pipette so dass der Durchmesser ist nur größer als der Durchmesser der Embryonen, so dass nur eine einzige Zygote wird betreten und verlassen die Pipette zu einer Zeit. Dies ermöglicht eine einzige Reihe zu bilden. Kleineren Durchmesser Pipetten können die Befruchtung Hülle abstreifen und stören die Zygoten als P. miniata Zygoten nicht über eine hyaline Membran einnd sind recht weich. </li><li> Wenn die Zygoten nicht auf die Kunststoffschale kleben, halten sie nicht für zusätzliche Zeit in Säure SW (bis zu mehreren Minuten). Alternativ kann ein kleiner Durchmesser Pipette kann bei der Beseitigung von Gallerthülle, damit die Zygoten, um effektiver halten zu helfen. </li><li> Die Zygoten sind leicht positiven Auftrieb und neigen dazu, zu schwimmen oder schweben knapp über dem Boden der Schale. In diesem Fall, positionieren Sie den Ruder Pipette, so dass die Zygoten werden sanft auf die Oberfläche der Schale wie sie aus der Pipette (3D) gedrückt. HINWEIS:. Es ist zulässig, viele Zeilen auf diesen Gerichten passen P. miniata embryonalen Membranen werden erst schwieriger, im Laufe der Zeit durchdringen und daher kann man Hunderte von Zygoten auf einem einzigen Gericht zu injizieren. </li></ol></li></ol> 4. Die Injektion von Zygotes <ol><li> Bereiten Injektionslösungen mit geeigneten Konzentrationen von Morpholino Antisense-Oligonukleotide (MASO), mRNA oder DNA in einer Endkonzentrationentration von 200 mM KCl. 400-800 uM MASO und 2,5 ng / ul DNA neigen dazu, morphanten Phänotypen bei gleichzeitiger Verringerung Toxizität. Die Endkonzentration in dem Ei 1/125 ten Ausgangskonzentration 14 sein. Injektionslösungen, die masos, Hitze auf 65 ° C für 5 min unmittelbar vor der Verwendung und bei Raumtemperatur lagern. <ol><li> Zur Vereinfachung der Sortier injizierten Embryonen, fügen Rhodamin Dextran Tracer zu der Injektionslösung in einer Konzentration von 0,1% zu erhalten. </li></ol></li><li> Bereiten Injektionsnadeln durch Ziehen Glaskapillarröhren (1,0 mm AD x 0,75 mm ID, 100 mm Länge) in einer Nadel ziehen Instrument folgenden Anweisungen des Herstellers. Geeignet für Injektionsnadeln in Seeigel auch gut für Seesterne, so verwenden ähnliche Parameter 19. </li><li> Legen Sie etwa 2 ul Injektionslösung in einer Injektionsnadel mit einem Microloader Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie die stumpfe Ende der Nadel in den manipulator. Stellen Picospritzer zu 100 ms Puls und einen Luftdruck von 40 PSI. </li><li> Legen Sie ein Gericht aus Embryonen ruderte auf den Mikroskoptisch und haben alle Embryonen in Feld. Orientierung der Schale, so dass die Ritzlinie auf der Seite am nächsten zu der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in einem ca. 60 ° Winkel, so ist die Spitze in der Nähe der Mitte der Linie und knapp über der Oberfläche des Wassers. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der eingekerbten Linie und Senken der Nadel, bis die Spitze in den Fokus kommt. Senken Sie die Spitze ein wenig mehr und brechen sie, indem Sie sie sanft in die Rippen der Ritzlinie geöffnet. Heben Sie die Spitze von der Oberfläche der Schale und wird es an der Spitze der ersten Reihe der Zygoten und konzentrieren sich auf die Zygoten. </li><li> Senken Sie die Spitze, so dass es das Zentrum der Zygote kam und in um einen Winkel von 60 ° aufspießen. Die Nadel dringt leicht P. miniata Zygoten. Schritt auf das Fußpedal (oder andere Mittel aus der Injektionsnadel zu zwingen Material), einen Bolus von inje einführenction Lösung in den Embryo. </li><li> Ziel für einen Bolus, die 20-30% ist der Durchmesser des Embryos oder zwischen 25 und 80 pl. Wenn der Bolus größer oder kleiner ist als diese, Einstellen der Einspritzzeit auf der Picospritzer und injizieren das nächste Embryo. Weiter, um die Dauer einzustellen, um die gewünschte Bolus Größe zu erhalten. Beginnen bei 100 ms Dauer. Re-Break die Nadel, wenn mehr als etwa 200 ms benötigt wird, um die entsprechende Bolus einzuführen. Entsorgen Sie die Nadel und bereiten eine neue, wenn weniger als 15-20 ms benötigt wird, um diese Größe zu erhalten Bolus, wenn die Nadel ist zu groß und kann die normale Entwicklung stören. </li><li> Gehen Sie, um die restlichen Zygoten an der Einspritz Gericht zu injizieren. Embryonen kann leicht bis Spaltung beginnt und in einzelne Blastomeren nach der ersten Spaltung injiziert werden. Regelmäßig heben Sie die Nadel über der Oberfläche des Wassers zu Zygoten, die auf die Nadel stecken zu entfernen. Falls erforderlich, erneut brechen die Spitze der Nadel oder laden Sie eine neue Nadel, wenn eine Blockade auftritt. </li></ol><ol><li> Lassen Sie die Embryonen bei 15 ° C in SW zu entwickeln. Aufrechterhaltung einer hohen Oberfläche zu Volumen in den Kulturen um den Sauerstoffaustausch ermöglichen. Stellen Sie sicher, Embryonen sind nicht überfüllt; Kulturen halten bei oder unter 200 Embryonen / ml. Je nach dem gewünschten Stadium der Embryo, planen injizierten Embryonen bei etwa 20-24 Stunden nach der Befruchtung zu sammeln. HINWEIS: Dies ist oft eine ideale Zeit, zu sortieren und zu sammeln, und weil in der Regel entwickelnden Embryonen leicht morphologisch unterscheiden, sind aber noch nicht schwimmen. </li><li> Wenn Embryonen geschlüpft, vorsichtig salzen Schock für Schwimmen verhindern. Geben Sie 200 ul 5 M NaCl auf 10 ml SW in der Einspritz Gericht unter leichtem Schwenken der SW. Nach ein paar Minuten werden die Embryonen auf den Boden der Schale fallen. Sammeln diese und verschieben Sie sie in den normalen Salzgehalt SW. </li><li> Sammeln injizierten Embryonen unter einem geeigneten Fluoreszenzlichtquelle mit dem Tracer im INJEKTIERT kompatibelon-Lösung. Wenn kein Tracer verwendet wurde, sortieren Embryonen für normale Morphologie zu wählen. </li><li> Mit dem Mund ansaugen, ziehen fluoreszierende Embryonen mit einer minimalen Menge von SW und blasen sie in eine kleine Kulturschale mit SW gefüllt. Ideal Mund Pipetten haben eine ausreichend große Öffnung für Embryonen und herausgezogen werden, ohne diese zu beschädigen, aber nicht so groß, dass unerwünschte Fremd Embryonen und SW sind ebenfalls nach oben gezogen wird. </li><li> Sobald alle gewünschten Embryonen wurden in die neue Schale gesammelt, beobachten die Embryonen unter Fluoreszenzlicht und entfernen Sie alle un-injizierten Embryonen oder schlecht entwickelte Embryonen. </li><li> Kultur sortiert Embryonen, um die gewünschten Stufen in einem Inkubator und fahren Sie mit Bildgebung oder anderen gewünschten Protokolle. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt von den Autoren.

Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wic...

Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke. In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit. Stachelhäuter, darunter P. miniata </em&gt;, erfordern viele Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen nicht praktisch, zu entwickeln und aufrechtzuerhalten transgenen Linien dieser Tiere für Experimente. Daher kann die Zucht von transgenen Erwachsene nicht effizient geändert Embryonen erstellen. Stattdessen müssen Störung auftreten, de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Ver...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Aufrufe.  Carnegie Mellon University.  Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies. 

Serie: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...