Dieses Protokoll ist nützlich, um die Assembling-Funktionen von bakteriellen Sekretionskomplexen zu charakterisieren und kann zu einem grundlegenden Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die für Wirtspathogen-Wechselwirkungen erforderlich sind. Diese Technik integriert komplementäre Ansätze, die die native Struktur der Probe erhalten und die Visualisierung von Proteinkomplexen in intakten Bakterienzellen ermöglichen und sehen. Es erhöht unser Verständnis der strukturellen Funktionsbeziehungen von bakteriellen Sekretionssystemen.
Diese Methode kann angepasst werden, um andere Arten von Sekretionssystemen oder anderen zellulären Komplexen in einer Vielzahl von Bakterienarten zu studieren. Beginnen Sie mit der Herstellung von Agarose-Pads für die Live-Zell-Bildgebung. Bereiten Sie ca. 30 ml 1%low melt Agarose Lösung in Wasser und Mikrowelle es in einem Glaskolben für etwa 90 Sekunden wirbeln es gelegentlich, bis die Agarose vollständig gelöst ist.
Platzieren Sie zwei 22 x 22 x 0,15 mm Glasschlitten am Rand eines 25 x 75 x 1,1mm Glasschlittens übereinander. Stapeln Sie dann zwei weitere der kleineren Folien auf der anderen Kante. Pipette ca. 1 ml der geschmolzenen Agarose in die Mitte gleiten zwischen den beiden oberen Glasrutschen und legen Sie eine weitere große Rutsche auf die geschmolzene Agarose, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Kühlen Sie die Dias bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, dann verwenden Sie ein Skalpell oder Rasierklinge, um das Pad sanft in kleine Quadrate zu schneiden. Befestigen Sie einen doppelseitigen Kleberahmen auf einem 25 x 75 x 1,1 mm Glasschlitten und legen Sie mehrere Pads auf den Schlitten. Lösen Sie ein schweres Pflaster von Legionella Pneumophila in 1 ml doppelt destilliertem Wasser auf.
Dann Wirbel und Pipette zwei bis drei Mikroliter der Verdünnung auf die Pads. Legen Sie einen 58 x 24 x 0,15 mm-Deckel über den Kleberahmen. Wählen Sie Zellen für die Bildgebung mit heller Feldbeleuchtung aus.
Passen Sie dann im Aufnahmefenster der Software des Mikroskops die ND auf 180 und die Binning auf zwei um zwei an. Verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal, um die Probe für 500 bis 1000 Millisekunden freizulegen und die Spezifität der Fluoreszenz zu validieren, indem Sie Legionella Pneumophila mit den gleichen Parametern abbilden. Um die Polarität zu quantifizieren, passen Sie den Bildkontrast so an, dass die Bakterien deutlich sichtbar sind.
Zoomen Sie dann auf den Bereich von Interesse und verwenden Sie das Regionswerkzeug, um ein 0,25 mal 1,3 Mikrometer Rechteck zu platzieren, das am Pol beginnt und sich in das Zytoplasma ausdehnt, um sicherzustellen, dass das Rechteck innerhalb der bakteriellen Grenzen verbleibt. Markieren Sie mindestens 200 Bakterien und erstellen Sie Masken, indem Sie die Schaltfläche "Region zum Maskieren" im Analysemenü verwenden. Klicken Sie auf Maskenstatistiken und wählen Sie das Objekt unter Maskenbereich aus.
Markieren Sie dann die mittlere Intensität und Varianz unter Features und Intensität. Exportieren Sie die Daten als Textdatei und verwenden Sie die Tabellenkalkulationsanwendung, um die Polaritätswerte jedes Bakteriums als Verhältnis zwischen der Varianz und der mittleren Intensität zu berechnen. Für Anwendungen mit hohem Durchsatz verwenden Sie Gesichtskontrastmikroskopie, um Dual-Channel-Bilder zu erfassen.
Achten Sie darauf, Sichtfelder zu wählen, in denen die Bakterien vollständig getrennt sind. Passen Sie als Nächstes den Gesichtskanalkontrast des Bildes auf eine Ebene an, auf der die Bakterien deutlich sichtbar sind. Öffnen Sie das Dual-Channel-Bild, und starten Sie das Fenster "Segmentmasken erstellen".
Passen Sie den entsprechenden Schwellenwert an, und entfernen Sie dann die kleinen Objekte, indem Sie auf die Schaltfläche Objekte definieren klicken und die Mindestgröße auf 100 Pixel anpassen. Wählen Sie unter Maske verfeinern Kantenobjekte und separate Masken von Bakterien, die nebeneinander liegen, aus. Um die Dynamik der Fusionsproteine zu quantifizieren, öffnen Sie das Bildaufnahmefenster und markieren Sie den Zeitraffer.
Geben Sie zwei in das Feld Anzahl der Zeitpunkte ein. Erwerben Sie zwei erfolgreiche Bilder von Legionella Pneumophila, die das fluoreszierende Protein von Interesse ausdrücken. Passen Sie den Bildkontrast an, bis die Zellen deutlich sichtbar sind.
Verwenden Sie dann das Regionswerkzeug, um ein 0,25 mal 0,25 Mikrometer-Quadrat in der Mitte von mindestens 400 Zellen zu platzieren. Verwenden Sie als Nächstes die Schaltfläche Bereich zum Maskieren im Analysemenü, um eine Maske der quadratisch interessierten Quadrate zu erstellen. Erstellen Sie eine neue leere Maske, und markieren Sie mit dem Pixelwerkzeug den gesamten Zellbereich von mindestens 25 zufälligen Zellen.
Erstellen Sie eine weitere Maske, und markieren Sie mit dem großen Pinselwerkzeug Bereiche zwischen den Zellen. Wählen Sie schließlich Maskenstatistiken aus, und stellen Sie sicher, dass das Objekt unter Maskenbereich für Maske 1 ausgewählt ist. Wählen Sie unter Features und Intensität die mittlere Intensität aus.
Exportieren Sie die Daten, und wiederholen Sie den Vorgang für Maske 2. Wählen Sie für Maske 3 die gesamte Maske aus, und exportieren Sie die mittlere Intensität. Um die Elektronenkryotomographie Probe vorzubereiten, wachsen sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf CYE Agrastreptomisumplatten.
Setzen Sie die Zellen in Wasser auf eine OD 600 von etwa 0,7 aus. Dann fügen Sie fünf Mikroliter kolloidalen Goldpartikel zu 20 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Glühen entlädt ein löchriges Kohlenstoffgitter und Pipette fünf Mikroliter der Zellmischung darauf.
Lassen Sie es für eine Minute stehen. Das Gitter mit Filterpapier bedrucken und mit einem schwerkraftgetriebenen Kolbengerät in flüssigem Ethan einfrieren. Nach dem Einsetzen von Superfolder GFP in das Legionella Pneumophila-Chromosom wurde eine livezellfluoreszierende Mikroskopie durchgeführt, um das fluoreszierende Signal mit dem des elterlichen Superfolders GFP zu vergleichen.
Darüber hinaus wurde die Hellfeldmikroskopie verwendet, um den Anteil der Zellen mit einem spezifischen fluoreszierenden Signal zu untersuchen. Nur ein Bruchteil der Zellen, die DotB-Superfolder GFP produzierten, zeigte eine polare Lokalisation des Fusionsproteins. Bei der Charakterisierung der Verteilung des DotB-Fluoreszenzsignals wurde festgestellt, dass die Intensität des DotB-Superfoldergfpbs an den Polen etwa zwei Mal höher war als im Zytosol.
Um zu untersuchen, ob die DotB-Superfolder GFP-Polarlokalisation von einem vollständig montierten Sekretionssystem Typ 4 abhängig war, wurden Polaritätswerte von DotB Superfolder GFP für einzelne Zellen in einem wilden Typ und in einem Typ-4-Sekretionssystemmutanten ermittelt. Tatsächlich verschwand die polare Positionierung des DotB-Superordners GFP, als das Dot/ICM-System gelöscht wurde. Dynamische Muster deuteten darauf hin, dass der DotB ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden war und in einer späten Montagereaktion in das polarlokalisierte Dot/ICM Typ 4-Sekretionssystem rekrutiert wurde.
Hochdurchsatz-Kryo-ET wurde verwendet, um das intakte Sekretionssystemgerät Typ 4 in einem Legionella Pneumophila-Stamm zu visualisieren, der DotB-Superfolder GFP exsemitt. Bei der Rekonstruktion der Zelle wurden mehrere Dot/ICM-Maschinen entdeckt, die in die Zellhülle eingebettet waren. Die Gesamtpositionierung von DotB und Superfolder GFP in Bezug auf die intakte Sekretionssystemmaschine Typ 4 wurde ebenfalls ermittelt.
Dreidimensionale Oberflächendarstellungen zeigten an, dass sich das Superfolder GFP unterhalb des DotB-Hexamers befindet, der sich als Scheibe an der Basis des zytoplasmatischen ATPase-Komplexes zusammensetzt. Achten Sie beim Versuch dieser Technik darauf, die Stabilität der Fusionsproteine und die Funktionalität des Tag-Sekretionssystems zu bewerten, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Modellierung und Anpassung können effektive Möglichkeiten sein, die dynamischen Muster und strukturellen Dichten zu analysieren sowie konforme Veränderungen oder die Lokalisierung von Untereinheiten in die Struktur zu bewerten.
Dieser Ansatz kann helfen zu verstehen, wie verschiedene Typ-vier geheime Systemkomponenten funktionieren, wie sie innerhalb des größeren Komplexes interagieren und welche Funktionen verschiedene Unterbaugruppen ausführen.
