Name: activating autophagy by aerobic exercise in mice
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice at JoVE.com

We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

Alle Verfahren mit Tieren wurden von der Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen nach Richtlinien durchgeführt. 1. Mausmodelle <ol><li> Verwenden Sie 8-12 Wochen alten Mäusen in der Ausübung Ausbildung. Zur Erkennung ausgeübt induzierten Autophagie in vivo, verwenden Sie das GFP-LC3 - transgenen Mäusen (C57BL / 6 Hintergrund) für die Bildgebung Studien und C57BL / 6 - Mäuse für biochemische Analysen. </li></ol> 2. Übung induzierten Autophagie <ol><li> Laufband - Setup - gezwungen Übung <ol><li> Akklimatisieren und trainieren, um die Mäuse auf einem 10 ° bergauf offen Tretmühle für 2 Tage. Am Tag 1 üben die Mäuse für 5 min bei 8 m / min, und am Tag 2, üben die Mäuse für 5 min bei 8 m / min um weitere 5 min , gefolgt von 10 m / min 10. Ermutigen Sie die Mäuse durch sanfte Hand Schubs zu laufen. </li><li> Am 3. Tag, ließ die Mäuse einen einzigen Anfall von Laufen für 90 Minuten auf 10 ° bergauf Laufband, starti unterziehenng mit der Geschwindigkeit von 10 m / min. Nach 40 min bei einer Geschwindigkeit von 1 m / min alle 10 min für insgesamt 30 Minuten, um die Laufbandgeschwindigkeit zu erhöhen, und erhöhen Sie die Geschwindigkeit mit der Geschwindigkeit von 1 m / min alle 5 min bis 17 m / min erreicht, für insgesamt 90 min von Trainingszeit und 1.070 Meter Distanz. </li><li> Stellen Sie den elektrischen Reiz auf einem niedrigen Intensitätsbereich (1,2 Hz), und fördern die Mäuse zu laufen wiederholt Fuß-Schock zu vermeiden. </li><li> Für Gewebesammlung, einschläfern die Mäuse durch Isofluran Inhalation, durch Genickbruch folgte unmittelbar nach dem Training. Anderen zugelassenen Euthanasie Methoden können auch verwendet werden, wie beispielsweise CO2 oder IP-Injektion von anderen Anästhetika. Die Höhe der Autophagie scheint nicht durch Methoden der Euthanasie betroffen sein. </li></ol></li><li> Laufen Rad Setup - Kür <ol><li> Platzieren einer Maus-Laufrad (11,4 cm Durchmesser) in einem Käfig mit einem einzigen untergebracht Maus. </li><li> Überprüfen Sie die Lauffähigkeit ein Fahrrad Kilometerzähler verwenden.Richten Sie das Rad Parameter [Abstand (in mm) pro volle Umdrehung des Rades] bei 358 (11,4 * π). Messen Sie die Laufstrecke nach 24 Stunden. </li><li> Lassen Sie die Maus freiwillig für 2 Wochen mit dem Laufrad laufen. Für Gewebesammlung, opfern, um die Maus am Morgen nach der Laufzeit. </li></ol></li></ol> 3. Autophagy Flux Bewertung <ol><li> Um die autophagischen Fluss unter Ruhe- und Belastungs-Bedingungen behandeln Mäuse mit dem Autophagie Inhibitor Chloroquin für drei Tage messen und vergleichen sie mit Mäusen, die mit PBS behandelt. <ol><li> Auflösen Chloroquin in PBS (5 mg / ml) und Injizieren Chloroquin in Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg / kg / Tag für drei aufeinanderfolgende Tage. Sacrifice Mäuse und sammeln Gewebe 3 Stunden nach der letzten Injektion. </li><li> Bei ausgeübten Mäusen vorzubehandeln sie mit Chloroquin für zwei aufeinanderfolgende Tage in einer Dosis von 50 mg / kg / Tag. Am dritten Tag spritzen die Mäuse mit der gleichen Konzentration von Chloroquin und nach90 Minuten ließ sie für weitere 90 Minuten auf dem Laufband laufen. </li><li> Euthanize die Mäuse durch Inhalation von Isofluran, durch zervikale Dislokation gefolgt. Sammeln Gewebe unmittelbar nach der Ausführung, so daß die gesamte Inkubationszeit von Chloroquin die gleiche wie Kontrolle (Ruhe-) -Mäuse (3 h). HINWEIS: Alternativ kann eine einzelne Injektion von Chloroquin verwenden, um die Autophagie Fluss in Mausgeweben zu bestimmen. </li></ol></li></ol> 4. Gewebe Ernte und Fixierung <ol><li> Vor Gewebe Ernte vorbereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und frischem 4% Paraformaldehyd (PFA, Vorsicht: Persönliche Schutzausrüstung erforderlich) in PBS bei einem endgültigen pH-Wert von 7,4. Bewahren Sie beide Lösungen bei 4 ° C. </li><li> Füllen 30 ml Spritze, die mit 15 bis 20 ml von 4% PFA (für GFP-LC3-Mäuse). Verbinden Sie die Spritze mit einer 20-G-Katheter Nadel. </li><li> Nach der Übung, einschläfern die Mäuse durch Isofluran Inhalation, durch Genickbruch folgte. </li><li> Legen Sie das Tier auf eine saubere Arbeitsfläche auf seiner back. Schneiden Sie und öffnen Sie die Brusthöhle durch das Zwerchfell schneiden das Herz aussetzen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Leber das Blut zu lassen kommen, und die Injektion sollte langsam in den rechten Ventrikel des Herzens über den Katheter insgesamt 15 ml 4% PFA, bis die Lunge und Leber völlig blaß. Perfundieren die Maus unmittelbar nach der Trainingseinheit, eine Spritzenpumpe mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml / h verwendet wird. </li><li> Die Nadel nach der Perfusion, zu entfernen und Gewebe von Interesse (zB Gehirn 11 und Skelettmuskel) sammeln. Für Skelettmuskel, sezieren die vastus lateralis. Kurz gesagt, nach hinten in die Haut des Beins ziehen die Muskeln zu entlarven, die Quadrizeps femoris 12 zu lokalisieren, und vastus lateralis sezieren aus, die der externe Muskel mit dem oberen Teil des Oberschenkelknochens angebracht ist. </li><li> Für weitere Fixierung und Dehydrierung, legen Sie die Gewebe von GFP-LC3 Mäuse in 4% PFA für 24 Stunden bei 4 ° C, und sie dann auf 15% übertragenSucrose-PBS bei 4ºC über Nacht oder bis das Gewebe angesiedelt haben, und dann auf 30% Saccharose-PBS bei 4ºC über Nacht oder für längere Lagerung. Halten Sie die Proben im Dunkeln so viel wie möglich, da sie zu stark lichtempfindlich sein. </li><li> Für Western-Blot-Analyse lassen Sie die Gewebe von C57BL / 6-Mäuse direkt in flüssigem Stickstoff, und lagern Sie sie bei -80 ° C einfrieren. </li></ol> 5. Imaging Analyse von GFP-LC3 Puncta <ol><li> Tissue - Prozess <ol><li> Pre-Behandlung das Gewebe (vorher in PFA fixiert und in 30% Saccharose gespeichert) in Einbettungsmedium, wie beispielsweise &quot;Optimal Cutting Temperatur compound&quot; (OCT) für ein paar Minuten in einem markierten kleine Petrischale. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe in einem markierten cryomold genügend frisches Oktober mit dem Gewebe zu decken. Richten Sie die Schnittfläche in Richtung der Unterseite des cryomold (Querschnitt für den Musculus vastus lateralis und Sagittalschnitt für den Hemi-Gehirn). Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. </li><li> freeze die Proben durch die cryomold für ein paar Minuten in einem bedeckten Schaum-Kühler mit Trockeneis gefüllt platzieren, bis die OCT-weiß wird. Wickeln Sie einzelne Proben in markierten Folien, versiegeln sie in eine Plastiktüte, und lagern Sie sie bei -80 ° C über Nacht oder länger. </li><li> Verwenden Sie einen Kryostaten Probenabschnitte mit einer Dicke von 10 um, und montieren Sie die Abschnitte auf den Folien zu schneiden. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C, und halten Sie immer die Dias weg vom Licht, wann immer möglich. </li></ol></li><li> Slide Vorbereitung <ol><li> Die Objektträger aus dem Gefrierschrank und tauen sie bei Raumtemperatur. Decken Sie den Gewebeschnitt mit einem Tropfen Eindeckmedium mit DAPI. Legen Sie ein Deckglas geeigneter Größe auf und Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> Verwenden Sie Nagellack die Ränder des Deckglases zu versiegeln, damit Nagellack im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen, und dann speichern Sie die Folien in einem lichtdichten Behälter bei 4 ° C, oder gehen Sie mit Imaging-Erfassung von GFP-LC3 puncta. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Die Quantifizierung von GFP - LC3 puncta durch Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Führen Sie Epifluoreszenzmikroskopie, Bilder im gleichen Zustand erfassen (Belichtung und Einstellungen) für alle Proben. Für GFP, verwenden Sie eine Emissionswellenlänge von 525 nm; für DAPI, verwenden 490 nm. mindestens zehn Bilder pro Probe Erwerben Sie ein 60X Ziel für vastus lateralis und den frontalen Kortex Region des Gehirns verwendet wird. </li><li> Quantifizierung die Anzahl der GFP-LC3 puncta in einem Gewebebereich von 2,500 &amp; mgr; m 2 in jedem Bild für die statistische Analyse, für die experimentellen Gruppen verblindet. Berechnen der durchschnittlichen Zahl von 10 Bilder von jeder Probe, wobei die automatische Messfunktion von &quot;Object Count&quot; verwendet wird. Einstellungen für den Musculus vastus lateralis sind: Schwellenwert L = 10, H = 200; 2X glätten; 1X sauber, und die Einstellungen für das Gehirn frontalen Kortex sind: Schwellenwert L = 11, H = 200; 2X glätten; 1X sauber. </li></ol></li></ol> 6. Western-Blot-Analyse auf Autophagy Marker <ol><li> &lt;strong&gt; Tissue Prozess <ol><li> Bereiten Sie die Lysepuffer: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitor (frisch hinzugefügt). </li><li> Entfernen des Gewebes von C57BL / 6-Mäuse von -80 ° C der Lagerung. Schneiden Sie das Muskelgewebe in kleine Stücke mit einer Rasierklinge vor dem folgenden Prozess. Hinzufügen, 800 &amp; mgr; l (für hemi-Hirn) oder 500 &amp; mgr; l (für vastus lateralis) kaltem Lysepuffer zur Probe. Homogenisieren der Probe bei 4 ° C mit einem Homogenisator bei einer mittleren Geschwindigkeit. </li><li> Vollständig lysieren die homogenisierte Mischung für weitere 30 min bis 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Spin down das Homogenat bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C, verwerfen das Pellet, und sammeln Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. </li></ol></li><li> autophagy Analyse <ol><li> Bestimmung der Proteinkonzentration von Gewebelysaten des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers. Normalisieren jede Probeauf die gleiche Konzentration. </li><li> Kombinieren Sie die Probe mit dem 2x Laemmli - Probenpuffer bei einem 1: 1 - Verhältnis, kochen sie bei 95 ° C für 5 - 10 min, und fahren Sie mit Western - Blot - Analyse auf Autophagie - Marker 13, 14, wie p62 (anti-p62 - Antikörper, 1: 500 Verdünnung) und LC3 (anti-LC3-Antikörper, 1: 500 Verdünnung). Koche die Proben unmittelbar nach der Zugabe des Probenpuffers, da längere Inkubation auf Eis mehrere abgebauten Banden LC3 erzeugen. </li><li> Quantifizieren p62 und LC3 Banden durch Densitometrieanalyse mit ImageJ und normalisieren den Wert auf den entsprechenden Aktin-Band. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Autophagie ist ein katabolischen Prozess, der Energie liefert, und reduziert die Zytotoxizität von lysosomalen Abbau von Cytoplasma-Bestandteile oder beschädigte Organellen. Autophagie Studium ist wichtig, dass die Regulation der zellulären Homöostase und die Mechanismen der Stressreaktion zu verstehen. Neue Modelle und Methoden entstehen 15, im Bereich der Forschung zu untersuchen , wie beeinträchtigte Autophagie zu zahlreichen pathologischen Prozessen beiträgt 16,</...

Autophagy ist ein evolutionär konservierten Abbauweg, die in Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen, wie Hunger und Hypoxie 1, 2 induziert wird. Während der Autophagie, Doppelmembranbläschen, die so genannte Autophagosomen, integrieren unnötige oder subzellulären Komponenten beschädigt und transportieren sie in die Lysosomen zum Abbau 3. Basal autophagy ist wesentlich für die zelluläre Funktion und Entwicklung des Organismus und die Beeinträchtigung der basalen autophagy wird in vielen Störungen in Verbindung gebracht, einschließlich Neurodegeneration, Tumorgenese und Typ 2 Diabetes 4, 5, 6. Die bekannteste physiologischen Autophagie Induktor Hunger. Es hat jedoch zwei wesentliche Beschränkungen. Zuerst nimmt Hunger eine lange Zeit , um effektiv Autophagie bei Tieren, zum Beispiel 48 Stunden von Lebensmitteln Einschränkung bei Mäusen induzierenin den meisten Organen. Zweitens induziert Verhungern kaum Gehirn autophagy, aufgrund einer relativ stabilen Nährstoffversorgung im Gehirn. In der Tat ist es auch autophagy Induktion von kleinen Molekül-Induktoren zu detektieren schwierig, da viele Medikamente die Blut-Hirn-Schranke passieren können. So um besser auf die Funktion der Autophagie Aktivierung in der Pathogenese der Erkrankung zu analysieren, haben wir entdeckt , vor kurzem , dass die Übung ein potenter physiologische Methode ist die Autophagie in einem kurzen Zeitraum 7, 8, 9 zu induzieren. Verglichen mit Hunger wird Autophagie effektiv induziert durch Laufband so schnell wie 30 Minuten läuft. Somit Übung ist eine bequeme und potente physiologische Ansatz, den Mechanismus der Autophagie zu studieren Nutzen für die Gesundheit bei der Vermittlung und Prävention von Krankheiten. Es gibt mehrere Proteinmarker zum Nachweis von autophagy Aktivität, einschließlich LC3 und p62. LC3 (Mikrotubuli-assoziierten Protein 1A / 1B-Licht chain 3) eine cytosolische Protein (LC3-I bilden), die an PE (Phosphatidylethanolamin), auf autophagy Induktions konjugiert ist. PE-lipidierter LC3 (LC3-II-Form) auf autophagosomalen Membranen rekrutiert und kann verwendet werden, Autophagosomen sichtbar zu machen, wenn sie mit GFP-markierten. Seine Translokation aus dem Cytosol Strukturen Autophagosomen unter Mikroskopie punktiert ist ein Hinweis auf autophagy Induktion. p62 ist ein Fracht Rezeptor für autophagy Substrate (wie Ubiquitinierung Proteine), und wird in Autophagosomen als auch eingearbeitet. Da das Protein in Lysosomen mit Autophagosomen abgebaut wird, kann dessen Ebenen die autophagy Fluss zu messen, verwendet werden. Hier zeigen wir, wie diese Marker zu verwenden, die Autophagie in verschiedenen Geweben der Maus durch Aerobic-Übungen induziert zu quantifizieren, einschließlich Zwangs Bewegung (Laufband) und Kür (Laufräder). Die gleichen Verfahren können auch zur in - vivo - Messung von autophagy nach der Behandlung von anderen Induktoren angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Treadmill</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Mouse running wheel</td><td>Super Pet</td><td>100079365</td><td>diameter 11.4 cm</td></tr><tr><td>Odometer</td><td>Bell</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>Model: inverted microscope ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Dieses Protokoll beschreibt zwei verschiedene Methoden Autophagie in Geweben der Maus durch Aerobic-Übungen zu induzieren: insgesamt 90 min von Zwangs Übung auf einer mehrspurigen Tretmühle von zwei Tagen der Eingewöhnung verlief; oder zwei Wochen nach der Kür auf einem Laufrad durch einzeln untergebracht Mäuse verwendet. In jeder Trainingsprotokoll, können wir die autophagy Fluss durch Fluoreszenzmikroskopie und Western Blot-Analyse in verschiedenen Organen zu messen. <p clas...

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy Aktivierung ist bei der Prävention von einer Reihe von Krankheiten nützlich. Eine der physiologischen Ansätze Autophagie in vivo zu induzieren körperliche Bewegung ist. Hier zeigen wir, wie die Autophagie von Aerobic-Übungen zu aktivieren und die Autophagie Ebenen bei Mäusen messen.

Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Aufrufe.  Northwestern University.  Autophagy Aktivierung ist bei der Prävention von einer Reihe von Krankheiten nützlich. Eine der physiologischen Ansätze Autophagie in vivo zu induzieren körperliche Bewegung ist. Hier zeigen wir, wie die Autophagie von Aerobic-Übungen zu aktivieren und die Autophagie Ebenen bei Mäusen messen. 

Serie: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Assessment of Murine Exercise Endurance Without the Use of a Shock Grid: An Alternative to Forced Exercise

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most common method for assessing exercise endurance in mice utilizes forced running on a motorized treadmill equipped with a shock grid. Animals who quit running are pushed by the moving treadmill belt onto a grid that delivers an electric foot shock; to escape the negative stimulus, the mice return to running on the belt. However, avoidance behavior and psychological stress due to use of a shock apparatus can interfere with quantitation of running endurance, as well as confound measurements of postexercise serum hormone and cytokine levels. Here, we demonstrate and validate a refined method to measure running endurance in na&#239;ve C57BL/6 laboratory mice on a motorized treadmill without utilizing a shock grid. When mice are preacclimated to the treadmill, they run voluntarily with gait speeds specific to each mouse. Use of the shock grid is replaced by gentle encouragement by a human operator using a tongue depressor, coupled with sensitivity to the voluntary willingness to run on the part of the mouse. Clear endpoints for quantifying running time-to-exhaustion for each mouse are defined and reflected in behavioral signs of exhaustion such as splayed posture and labored breathing. This method is a humane refinement which also decreases the confounding effects of stress on experimental parameters.

A method to assess exercise endurance in laboratory mice without the use of a shock grid is demonstrated. This method is a humane refinement that can decrease the confounding effects of stress on experimental parameters.

Beurteilung der Murine sportliche Ausdauer, ohne die Verwendung eines Shock Grid: Eine Alternative zur Zwangsübung

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most ...

Forschung

Verhalten

Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by international guidelines for patients suffering from cardiovascular diseases, more specifically, lower extremity artery diseases, where the patients' walking capacity is considerably altered, affecting their quality of life. 
Traditionally, both low continuous exercise and interval training have been used. Recently, supramaximal training has also been shown to improve athletes' performances via vascular adaptations, amongst other mechanisms. The combination of this type of training with hypoxia could bring an additional and/or synergic effect, which could be of interest for certain pathologies. Here, we describe how to perform supramaximal intensity training sessions in hypoxia on healthy mice at 150% of their maximal speed, using a motorized treadmill and a hypoxic box. We also show how to dissect the mouse in order to retrieve organs of interest, particularly the pulmonary artery, the abdominal aorta, and the iliac artery. Finally, we show how to perform ex vivo vascular function assessment on the retrieved vessels, using isometric tension studies.

High-intensity training in hypoxia is a protocol that has been proven to induce vascular adaptations potentially beneficial in some patients and to improve athletes&#39; repeated sprint ability. Here, we test the feasibility of training mice using that protocol and identify those vascular adaptations using ex vivo vascular function assessment.

Supramaximalen hypoxischer Intensität und Gefäßfunktion Bewertung bei Mäusen

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Entwicklungsbiologie

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Immunologie und Infektion

Short Session High Intensity Interval Training and Treadmill Assessment in Aged Mice

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, with regimens less than or equal to 10 min is of particular interest as several human studies feature routines as short as a few minutes a couple times a week. However, there is a paucity of animal studies that model the impacts of short session HIIT. Here, we describe a methodology for an individually tailored and progressive short session HIIT regimen of 10 min given 3 days a week for aged mice using an inclined treadmill. Our methodology also includes protocols for treadmill assessment. Mice are initially acclimatized to the treadmill and then given baseline flat and uphill treadmill assessments. Exercise sessions begin with a 3 min warm-up, then three intervals of 1 min at a fast pace, followed by 1 min at an active recovery pace. Following these intervals, the mice are given a final segment that starts at the fast pace and accelerates for 1 min. The HIIT protocol is individually tailored as the speed and intensity for each mouse are determined based upon initial anaerobic assessment scores. Additionally, we detail the conditions for increasing or decreasing the intensity for individual mice depending on performance. Finally, intensity is increased for all mice every two weeks. We previously reported in this protocol enhanced physical performance in aged male mice and here show it also increases treadmill performance in aged female mice. Advantages of our protocol include low administration time (about 15 min per 6 mice, 3 days a week), strategy for individualizing for mice to better model prescribed exercise, and a modular design that allows for the addition or removal of the number and length of intervals to titrate exercise benefits.

Short session (&#8804;10 min) high intensity interval training (HIIT) is emerging as an alternative to longer exercise modalities, yet the shorter variants are rarely modeled in animal studies. Here, we describe a 10 min, 3 day a week, uphill treadmill HIIT protocol that enhances physical performance in male and female aged mice.

Kurze Sitzung High Intensity Intervalltraining und Laufband-Beurteilung im Alter Mäuse

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biologie

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and further explore whether its mechanism is related to the impact of mitophagy. This study also aimed to demonstrate the therapeutic effect of safflower acid on oxidative stress in cardiomyocytes and explore whether its mechanism is related to the effect of mitophagy. Here, an H2O2-based oxidative stress model was constructed and assessed the degree of oxidative stress injury of cardiomyocytes by detecting the levels of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH Px). Reactive oxygen species (ROS)-detecting fluorescent dye DCFH-DA, JC-1 dye, and TUNEL dye were employed to assess mitochondrial damage and apoptosis. Autophagic flux was measured by transfecting Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-related proteins were then detected via western blotting and immunofluorescence. However, crocetin (0.1-10 &#181;M) could significantly improve cell viability and reduce apoptosis and oxidative stress damage caused by H2O2. In cells with excessive autophagic activation, crocetin could also reduce autophagy flow and the expression of mitophagy-related proteins PINK1 and Parkin, and reverse the transfer of Parkin to mitochondria. Crocetin could reduce H2O2-mediated oxidative stress damage and the apoptosis of H9c2 cells, and its mechanism was closely related to mitophagy.

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Based on in vitro experiments, this study revealed the mechanism of crocetin in repairing oxidative stress damage of cardiomyocytes by influencing mitophagy, in which the PINK1/Parkin signaling pathway plays an important role.

Schutz von H9c2-Myokardzellen vor oxidativem Stress durch Crocetin über den PINK1/Parkin-Signalweg vermittelte Mitophagie

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Medizin

Erforschung von T2DM-Übungsinterventionen: Ein statisches Trainingsgerät für Mäuse

Static Strength Training Method for Type 2 Diabetic Mice

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. Static strength training is one of the key forms of traditional sports in China. Research shows that static strength training is an effective clinical method for T2DM intervention, but there is no experimental device suitable for static training in mice. One of the difficulties in moving from clinical to basic research is to design appropriate experimental devices. In order to further study the mechanism of static training intervention in T2DM, a simple method for making a static training device for mice is introduced in this paper. This device has the advantages of simple operation, cheap material, and high feasibility. Previous studies conducted under this protocol have shown that static training can effectively reduce blood glucose levels and improve the mitochondrial function of skeletal muscle cells in T2DM mice. The purpose of introducing this device is to promote research on the mechanism of traditional exercise in the intervention of T2DM and to lay a foundation for the quantitative intervention of exercise.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Diabetesforschung mit statischem Bewegungstraining bei Mäusen

This protocol provides a simple method of making static training equipment for mice. The device maintains the muscle isometric contraction of the limbs of mice so as to verify the intervention effect of traditional exercise on type 2 diabetes (T2DM) and provides new exercise therapy for the clinical treatment of T2DM.

Statische Krafttrainingsmethode für Typ-2-Diabetiker

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. ...

Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Zusammenfassung

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Beurteilung der Murine sportliche Ausdauer, ohne die Verwendung eines Shock Grid: Eine Alternative zur Zwangsübung

Supramaximalen hypoxischer Intensität und Gefäßfunktion Bewertung bei Mäusen

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Kurze Sitzung High Intensity Intervalltraining und Laufband-Beurteilung im Alter Mäuse

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Schutz von H9c2-Myokardzellen vor oxidativem Stress durch Crocetin über den PINK1/Parkin-Signalweg vermittelte Mitophagie

Statische Krafttrainingsmethode für Typ-2-Diabetiker

Statische Krafttrainingsmethode für Typ-2-Diabetiker

Statische Krafttrainingsmethode für Typ-2-Diabetiker