Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Die Nanoporensequenzierung der dritten Generation ist eine leistungsstarke neuartige Sequenzierungstechnologie, die es ermöglicht, sehr einfach Sequenzinformationen aus einer Vielzahl von Proben zu erhalten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Portabilität des Sequenzierungsgeräts, die extrem lange Leselänge und die Echtzeitverfügbarkeit von Daten. Die Nanoporensequenzierung ist eine besonders hilfreiche Technologie bei Krankheitsausbrüchen an abgelegenen Orten.

Es wurde während und nach dem Ausbruch des Ebola-Virus in West- und Zentralafrika erfolgreich in Feldlabors eingesetzt. Durch die Nanosporensequenzierung und die Verwendung des MinION-Geräts zu diesem Zweck ist es recht einfach, bei der Bibliotheksvorbereitung und beim Laden der Durchflusszellen Vorsicht geboten. Um dieses Verfahren zu beginnen, richten Sie eine Touchdown-PCR ein, um die cDNA mit Primer-Set eins mit einem Hot-Start High-Fidelity-DNA-Polymerase mit dem entsprechenden Reaktionspuffer in einem 50-Mikroliter-Reaktionsvolumen mit einer Mikroliter-Vorlage zu verstärken.

Wenn möglich, richten Sie die Reaktion auf Eis oder in einem kühlen Block bei vier Grad Celsius ein. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach 50 Mikroliter des PCR-Produkts in ein 1,5 Milliliter DNA-Arme-Reaktionsrohr übertragen.

Setzen Sie die magnetischen Perlen gründlich durch Wirbel nen. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Perlen in die PCR-Reaktion und gut mischen. Inkubieren Sie die Probe auf einem rotierenden Mischer für fünf Minuten bei Raumtemperatur, während Sie bei 15 Umdrehungen drehen.

Drehen Sie die Probe kurz herunter und legen Sie das Rohr dann auf ein magnetisches Rack, um die magnetischen Perlen zu pellet. Warten Sie, bis der Überstand vollständig geklärt ist, bevor Sie fortfahren. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören, und entsorgen Sie ihn.

200 Mikroliter 70%Ethanol in das Reaktionsrohr geben und 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren. Das Ethanol ansaugen, ohne das Perlenpellet zu stören, und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang mit Ethanol noch einmal für insgesamt zwei Wäschen.

Das Pellet bei Raumtemperatur eine Minute lang an der Luft trocknen. Entfernen Sie dann das Reaktionsrohr aus dem Magnetgestell. Das Pellet in 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser aufhängen und bei Raumtemperatur für zwei Minuten brüten.

Legen Sie das Reaktionsrohr wieder auf das Magnetgestell und warten Sie, bis die Reaktionsperlen vollständig pelleted sind. Danach den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören und in ein neues 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr zu übertragen. Sollen mehrere Proben gleichzeitig sequenziert werden, können Barcodes nun durch zwei zusätzliche PCR-Schritte gefolgt von der DNA-Bereinigung hinzugefügt werden, wie zuvor gezeigt.

Kombinieren Sie zunächst eine gleiche Menge Barcode-DNA aus jeder Probe für insgesamt ein Mikrogramm DNA in einem Volumen von 45 Mikrolitern in einem 0,2 Milliliter Reaktionsröhre. Für dA-Tailing sieben Mikroliter Endvorbereitungsreaktionspuffer, drei Mikroliter Endvorbereitungsenzymmix und fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen. Streichen Sie vorsichtig die Röhre, um sie zu mischen.

In einem Thermocycler, inkubieren Sie die Reaktion für fünf Minuten bei 20 Grad Celsius, gefolgt von fünf Minuten bei 65 Grad Celsius. Führen Sie als Nächstes die PCR-Reinigung des Reaktionsprodukts wie im Textprotokoll beschrieben durch. Nehmen Sie optional einen Mikroliter, um die Konzentration der Probe mit einem UV-Spektralphotometer zu quantifizieren.

Kombinieren Sie 22,5 Mikroliter der zuvor erhaltenen gereinigten DNA mit 2,5 Mikroliter1D2-Adapter und 25 Mikroliter Blunt/TA Ligase Master Mix in einem neuen 1,5-Milliliter-DNA-Tiefenreaktionsrohr. Streichen Sie vorsichtig die Röhre, um sie zu mischen. Drehen Sie die Mischung kurz herunter und brüten Sie bei Raumtemperatur 10 Minuten lang.

Führen Sie dann die PCR-Reinigung des Reaktionsprodukts wie im Textprotokoll beschrieben durch. Kombinieren Sie 45 Mikroliter des Reaktionsprodukts mit fünf Mikroliter Barcode-Adapter-Mix und 50 Mikroliter Blunt/TA Ligase Master Mix in einem DNA-Low-Binding-Reaktionsrohr. Sanft streichen, um zu mischen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Reinigen Sie das Reaktionsprodukt, wie im Textprotokoll beschrieben, und lagern Sie das resultierende Produkt auf Eis oder bei vier Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist. Führen Sie zunächst eine Qualitätsprüfung für die Durchflusszelle durch. Schließen Sie zu diesem Zweck das Sequenzierungsgerät an den Hostcomputer an, und öffnen Sie die Software.

Fügen Sie eine Durchflusszelle in das Sequenzierungsgerät ein. Wählen Sie dann den Flusszellentyp aus dem Auswahlfeld aus, und klicken Sie auf Verfügbar, um dies zu bestätigen. Klicken Sie am unteren Bildschirmrand auf Flow-Zelle überprüfen und wählen Sie den richtigen Durchflusszellentyp aus.

Klicken Sie auf Test starten, um die Qualitätsprüfung zu starten. Für die Einsetzung der Durchflusszelle sind insgesamt mindestens 800 aktive Nanoporen erforderlich. Öffnen Sie zunächst die Grundierungs-Portabdeckung, indem Sie sie im Uhrzeigersinn verschieben.

Stellen Sie eine P1000 Pipette auf 200 Mikroliter ein und legen Sie die Spitze in den Grundierungsanschluss ein. Stellen Sie dann die Pipette auf 230 Mikroliter ein, während Sie die Spitze im Grundierungsanschluss halten, um 20 bis 30 Mikroliter Puffer zu erstellen und Luftblasen zu entfernen. In einem neuen 1,5 Milliliter DNA-Tiefenreaktionsrohr bereiten Sie die Grundierungsmischung vor, indem Sie 576 Mikroliter RBF-Puffer mit 624 Mikroliter nukleasefreiem Wasser kombinieren.

800 Mikroliter der vorbereiteten Grundierung vorsichtig in den Grundierungsport geben und fünf Minuten warten. Danach die Probenanschlussabdeckung und Pipette um weitere 200 Mikroliter der vorbereiteten Grundierungsmischung in den Grundierungsanschluss heben. Pipette 35 Mikroliter des RBF Puffer in eine neue saubere 1,5 Milliliter DNA Niedrigbindung Reaktionsröhre.

MISCHEN Sie LLB-Perlen gründlich durch Pipettieren und fügen Sie 25,5 Mikroliter der Perlen in den RBF-Puffer. Als nächstes fügen Sie 2,5 Mikroliter Nuklease freies Wasser und 12 Mikroliter DNA-Bibliothek hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. Fügen Sie 75 Mikroliter der Probenmischung in einer langsamen Tropfen weise Weise in die Durchflusszelle über den Probenanschluss.

Ersetzen Sie dann die Abdeckung des Probenanschlusses, schließen Sie den Grundierungsanschluss und schließen Sie den Deckel der Sequenzierungsvorrichtung. Bestätigen Sie innerhalb der Software, dass die Durchflusszelle noch verfügbar ist. Öffnen Sie ein neues Experiment, und richten Sie die Ausführungsparameter ein, indem Sie das verwendete Kit auswählen.

Wählen Sie Live Basecalling aus. Starten Sie die Sequenzierung, indem Sie auf Experiment starten klicken. Setzen Sie den Sequenzierungslauf fort, bis genügend experimentelle Daten gesammelt werden.

In einem repräsentativen Experiment wird die RNA aus 10 verschiedenen Blutproben von fünf Tierarten extrahiert. RNA-Konzentrationen werden zwischen 43 Nanogramm und 543 Nanogramm pro Mikroliter beobachtet. Nach der Verstärkung durch RT-PCR zeigt die Gelanalyse der MPC1 PCR-Produkte verschiedene Ergebnisse mit deutlich schwächeren Bändern für die Proben BC01 und BC02.

Diese Unterschiede werden höchstwahrscheinlich durch Unterschiede in der Probenqualität verursacht, obwohl Unterschiede in der PCR-Wirksamkeit aufgrund von Unterschieden in der Primerbindung an das MCP1-Gen verschiedener Arten nicht ausgeschlossen werden können. Diese Unterschiede in der Ertrags- und/oder Verstärkungseffizienz wirken sich jedoch nicht deutlich auf das Gesamtsequenzierungsergebnis aus. Anschließend wird eine Teilmenge von 10.000 erhaltenen Lesevorgängen ausgewählt und für die weitere Analyse entmultiplext.

Von den analysierten 10.000 Lesevorgängen zeigen 5 457 eine Länge zwischen 1, 750 und 2 000 Nukleotiden, die den erwarteten Größen für die PCR-Fragmente entspricht, die im Rahmen unseres Workflows verstärkt werden. Ein zusätzlicher Spitzenwert in der Längenverteilung von Lesevorgängen wird zwischen 250 und 500 Nukleotiden beobachtet, die auf unspezifische PCR-Produkte zurückgeführt werden können. Die Demultiplexing von Lesevorgängen ermöglicht die Zuordnung von 87,6 % der Lesevorgänge zu einer der 10 analysierten Proben.

Während diese Methode ziemlich zuverlässig ist, unter Feldbedingungen, die PCR-Verstärkung ist der problematischste Schritt. Während unserer Erfahrungen waren verschachtelte Protokolle oft notwendig, um Zielsequenzen zu verstärken. Neben der Sequenzierung von Tierwirtsgenen kann diese Methode auch verwendet werden, um jede DNA oder RNA einschließlich viraler oder bakterieller Krankheitserreger zu sequenzieren.

Die Nanoporensequenzierung wird daher zunehmend nicht nur bei Krankheitsausbrüchen oder für wissenschaftliche Studien an entlegenen Orten eingesetzt, sondern auch in regulären Laboratorien, in denen die langen Leselängen spannende neue Forschungsmöglichkeiten eröffnen. Obwohl keines der verwendeten Reagenzien besonders gefährlich ist, sollten die üblichen guten Laborpraktiken befolgt werden. Selbstverständlich sind bei der Sequenzierung von Krankheitserregern alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit diesen Wirkstoffen zu beachten.