Unser Protokoll wurde entwickelt, um einen feinen Test für die Fruchtfliege durchzuführen, die ein leistungsstarker Modellorganismus ist, der es ermöglicht, für alle Gene, Rezeptoren, Neuronen und Neuro-Psych-Köpfe zu entwerfen, die an Testsensation und Nahrungsverzehr beteiligt sind. Wie Menschen fliegen wie Lebensmittel, die schmecken: süß, leicht salzig, leicht sauer oder ablehnende Lebensmittel, die bitter, zu salzig oder zu sauer schmecken. Die Kraft dieser Technik kommt von der Geschwindigkeit und Bequemlichkeit.
Sie können viele verschiedene Fliegen in kurzer Zeit PRH ohne ein komplexes Setup testen. Unsere Methode ist ein ausgezeichneter, ausgezeichneter Test, um zu verstehen, ob Fliegen wie ein, genau wie ein bestimmtes Lebensmittel, sowie wie bestimmte Genprodukte Die Geschmackspräferenz beeinflussen. Es kann eine Herausforderung sein, festzustellen, ob Tiere bestimmte Lebensmittel annehmen oder ablehnen.
Daher ist es wichtig, ein Standardprotokoll für die Prüfung der Geschmackspräferenz von Tieren zu erstellen. Um Hungerfläschchen für den Assay vorzubereiten, verdichten Sie lose ein Stück Gewebe an der Unterseite jeder leeren Kunststofffliegendurchstechs pro zu testendem Gentyp. So dass das Papier diesen Raum füllt, ohne eine dichte Masse zu bilden, bei etwa drei Milliliterr reinem Wasser zu jeder Durchstechflasche, um das Gewebe vollständig zu sättigen, ohne stehendes Wasser zu haben.
Achten Sie darauf, dass es keine großen Tröpfchen überschüssigen Wassers an den Wänden der Fläschchen gibt. Alternativ können fünf Milliliter 1%Agros ohne Saccharose durch das eingeweichte Papier ersetzt werden, 24 Stunden vor dem Experiment hat Kohlendioxid zwei bis vier Tage alte Fliegen besäugert und die Fliegen in Gruppen von etwa 70 sortiert. Dann fügen Sie jede Gruppe von Fliegen zu einem Hungerteufel und beschriften Sie jede Durchstechflasche mit dem Genotyp und der Zeit der Hungerinitiation.
Vor der Durchführung eines Experiments, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen für jeden Farbstoff mit dem gleichen Lebensmittel mit jeder unterschiedlichen Farbstofffarbe. Kombiniert 0,5 Gramm Agros mit 50 Milliliterr reinem Wasser in einem Mikrowellen-sicheren Gefäß und erhitzen Sie die Agro-Lösung, bis sie sich bei Bedarf gelöst hat. Lösen Sie jede Lebensmittelkomponente, einschließlich Saccharose und alle experimentellen Verbindungen in Wasser, mit einer 100-fachen oder höheren Konzentration der abschließend getesteten Konzentration auf.
Und mischen Sie den Agrofarbstoff und die gewünschte Experimentelle Verbindung in konischen, Polypropylen-Zentrifugenrohren. Nach dem Mischen legen Sie die Rohre in das 60 Grad Celsius Wasserbad bis zur Verteilung und fügen Sie einen Milliliter einer Farbe der experimentellen Lebensmittel- und Farbstofflösungen auf eine Seite der ersten Assayschale. Lassen Sie die Agros abkühlen, bis sie fest sind, bevor Sie einen Milliliter der Kontroll-Lebensmittellösung hinzufügen, die mit der zweiten Farbfarbe auf der anderen Seite der Schale gekennzeichnet ist.
Dann wiederholen Sie die Assay-Schale Vorbereitung, mit der entgegengesetzten Kontrolle und experimentelle Farbstoff Lösung Paar. Verwenden Sie die Ergebnisse, um zwei Farbstoffkonzentrationen zu identifizieren, die einen Präferenzindex von Null ergeben. Wenn keine experimentelle Verbindung hinzugefügt wird.
Um einen zweiseitigen Fütterungstest durchzuführen. Zunächst lähmte eine experimentelle Fliege drei bis fünf Minuten auf Eis, bis keine offensichtlichen motorischen Aktivitäten wie Fliegen und Klettern beobachtet werden. Sobald die Fliegen immobilisiert sind, umkehren Sie sanft die Durchstechflasche und tippen Sie, um die Fliegen in die Assaykammer zu übertragen, dann legen Sie den Deckel schnell auf die Kammer.
Wenn alle Gruppen verlegt wurden, bewegen Sie alle Assay-Kammern für 90 Minuten in einen dunklen und geschlossenen Raum. Am Ende des Assays invertieren Sie die Kammern bei einem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius für etwa eine Stunde. Bevor Sie jede Kammer unter ein Stereomikroskop stellen, um die Bauchfarbe der Fliegen in jeder experimentellen Gruppe zu untersuchen.
Zählen Sie eine Fliege, wenn der Bauch mehr als 50% gefärbt ist, was auf eine robuste Fütterung hindeutet, entsorgen Sie alle Fliegen, in denen der Bauch nur einen winzigen Nahrungsfleck enthält, was auf schlechte Ernährung hindeutet. Wenn alle Fliegen gezählt wurden, verwenden Sie die Gleichung, um den Lebensmittelpräferenzindex für jede Gruppe zu quantifizieren. In diesem Test wurde eine 35-Millimeter-Schale in zwei Wochen unterteilt, in denen wir Inteilen mit Agro-Lebensmitteln, gepaart mit rotem oder blauem Farbstoff, füttern.
Um Die Farbverzerrung auszuschließen, wurden die blauen und roten Farbstoffkonzentrationen sorgfältig verfeinert, um eine ungefähre Nullpräferenz zu ergeben, wenn nur diese beiden Farbstoffe hinzugefügt wurden, 90 Minuten nach dem nassen hungernden Erwachsenenfliegen, das bly Bauchfarben als blau oder rot auftraten. Wenn das Tier überwiegend blaue stämisch oder rote Nahrung verzehrte, wenn eine Fliege sowohl blau als auch rot verzehrte, erschien der Bauch lila. Es wurden nur Fliegen gezählt, die eine beträchtliche Menge an Nahrung aufgenommen hatten, während Fliegen mit unzureichender Nahrungsaufnahme nicht gezählt wurden.
Der Vergleich dieses Petrischalen-basierten Assays mit dem Multi-Well-Platte-basierten Assay ergab, dass die beiden Fütterungsmethoden im Wesentlichen die gleichen Fütterungsergebnisse als Reaktion auf süße, bittere und salzige Nahrung in Wildfliegen ergaben. Bemerkenswert ist jedoch, dass es viel schneller ist, Lebensmittel in einer Petrischale zuzubereiten und zu verteilen als in einem 60-Well-Multi-Well-Teller. Achten Sie darauf, zu identifizieren, welche Farbstoffkonzentration vor allem nach der Herstellung einer neuen Diät-Charge zu verwenden.
Diese Konzentration kann zwischen den Fluglinien unterschiedlich sein. Unser Paar heute basiert zwei-Wahl-Assay ist auch sehr mächtig. Für Sie fragen, wie die Fliegen, spüren Sie sowohl innen-externe Rahmen beschädigt, um realen Zustand geeignete Fütterung und Verhalten.
