Diese Studie wurde unterstützt durch die Verteidigung Bedrohung Reduktion Agency (DTRA) unter Vertrag HDTRA1-14-C-0116 und Center for Excellence in der Infektion Genomik (DOD #W911NF-11-1-0136).

diese Arbeit erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health. Tierische Protokolle mit Nagetieren wurden genehmigt von der University of Texas at San Antonio institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) unter Protokoll MU009(RA).
 1. bereiten Katheter, Luftröhre Indikator und F. Tularensis Inokulum <ol><li>Bereiten Katheter (20 x 2 Zoll) <ol><li>Cut 20 x 2 Zoll Nadel und Schleifen die Nadelspitze zu einem stumpfen und glatten finish mit einem Drehwerkzeug. 
		Hinweis: Die Länge der abgestumpften Nadel dürfen die Metallspitze, ca. 3 mm in die Katheter-Hülse bei vollständigem Aufliegen auf die abgestumpften Nadel zurückzutreten. Die abgestumpften Nadel gibt die Katheter strukturelle Steifigkeit zur Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu ermöglichen, und das Fehlen der abgestumpften Nadelspitze ragen aus dem Katheter Ärmel verhindert Verletzungen zur Trachea.</li>
		<li>Stumpfen Nadeln und Katheter mit 70 % Ethanol reinigen und sterilisieren unter UV-Licht für 15 min.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Luftröhre Indikator <ol><li>trimmen eine 1.000 µL Pipettenspitze erlauben die Spitze zu sitzen in einer Katheter-Öffnung und eine luftdichte Abdichtung.</li>
		<li>Entfernen Sie einen Filter aus einer 200 µL Aerosol Barriere Pipettenspitze und innerhalb der zuvor zugeschnittenen 1.000 µL Pipettenspitze.</li>
		<li>Gewährleisten der Filter kann sich frei bewegen in die 1.000 µL Pipettenspitze wenn die Spitze Spitze nach unten gerichtet ist.</li>
	</ol></li> <li>F. Tularensis Inokulum <ol><li>wachsen F. Tularensis Belastung über Nacht auf entsprechende Nährbodenplatte bei 37 ° C. Kratzen ca. 100 µL der bakteriellen Rasen von der Agarplatte mit einer sterilen Schleife und verwenden, um eine 500 mL Erlenmeyerkolben mit 250 mL des entsprechenden flüssigen Wachstumsmedium impfen impfen (FN: tryptic Soy Bouillon (TSB) ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat) und inkubieren Sie schütteln über Nacht bei 37 ° c 
		Hinweis: F. Novicida in dem Video verwendet wurde angebaut, auf einer tryptic Soy Agar (TSA) Platte ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat.</li>
		<li>Über Nacht gewachsenen Flüssigkultur 4.221 x g bei Raumtemperatur für 10 min Zentrifugieren und entfernen den Überstand ohne Unterbrechung der Bakterien-Pellet. 
		Achtung: Befolgen Sie Institution &#39; s Biosafety Empfehlungen überstand verwerfen.</li>
		<li>Sanft wieder aussetzen der bakterielle Pellet mit 25 mL des entsprechenden flüssigen Medium (Fn: TSB ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat) mit 10 % Glycerin, mit einer Pipette 25 mL.</li>
		<li>Mit einer 1-mL-Pipette, aliquoten die resuspendierte Bakterienkultur in 500 µL-Aliquots in Fläschchen, Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und Lagern bei-80 ° c</li>
		<li>Zu bestimmen, die Titer der gefrorenen Kultur Durchstechflaschen, entfernen Sie zwei gefrorenen Fläschchen bei-80 ° C gelagert, auf Eis auftauen und durchführen Verdünnungsreihen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von Beschichtung auf geeigneten Wachstumsmedium (Fn: TSA mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid). Sind die Platten inkubierten 24-48 h bei 37 ° C und Kolonie bildende Einheiten (KBE) werden zur Berechnung der Anzahl von bakteriellen Zellen innerhalb der gefrorenen Kultur Fläschchen (Durchschnitt von zwei Fläschchen) aufgezählt.</li>
		<li>Bereiten das bakterielle Inokulum von einem gefrorenen Fläschchen auf Eis auftauen und dann verdünnen die Kultur mit PBS auf die Endkonzentration von 10 7 KBE/100 µL. Das Inokulum sollte in einer Konzentration, die die gewünschte KBE in 100 µL erbringt (Endkonzentration von Glycerin in das Inokulum kann nicht mehr als 3 % sein, Erstickung der Ratte zu verhindern). Gefrorene Kultur Fläschchen bei-80 ° C gelagert können für bis zu sechs Monate nach der Zubereitung verwendet werden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Ratte Narkose <ol><li>verbinden die Anästhesie-Kammer zum richtig operative Isofluran Verdampfer von einem Anästhesiegerät.</li>
	<li>Verbinden das Gas Schlauch auf die Anästhesie-Kammer mit dem Gas System aufräumen aufräumen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Sauerstoffzufuhr auf Anästhesiegerät, 4 L/min.</li>
	<li>Den Verdampfer Isoflurane auf 5 % festgelegt.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in der Anästhesie Kammer. 
	Hinweis: Wir nutzen in der Regel Ratten zwischen 8-10 Wochen alt (130-180 g); jüngere Ratten sind schwierig, über diese Technik aufgrund der geringen Größe der Mundhöhle impfen.</li>
	<li>Wenn die Induktion der Anästhesie stattgefunden hat, pflegen die Ratte bei 5 % Isofluran, 2 L/min Sauerstoff zur Wirkung. Dieser Vorgang dauert ca. 3-10 min.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Tiefe der Narkose durch die Qualität und die Rate von Atmung und Herzschlag und Reaktion auf reflex Stimulation wie die Zehe Kneiftest. Ideale Tiefe der Narkose wird durch 1-1,5 s Graf zwischen jedem Atemzug angezeigt.</li>
</ol> 3. Intratrachealen Impfung <ol><li>die Ratte aus der Anästhesie-Kammer und die Ratte dorsal am Nagetier Intubation Stand. Befestigen Sie die vorderen Zähnen der Ratte an den Halter Ratte in Position zu halten. 
	Hinweis: Wenn die Ratte anfängt, während des Verfahrens zu wecken, der Katheter entfernt werden und die Ratte nach der Anästhesie-Kammer, eine tiefere Ebene der Narkose zu erreichen.</li>
	<li>Dominante Hand zu verwenden, um die Zunge auf derselben Seite wie Unterstützung Hand mit breiten Punkt Dressing Daumen Zange bewegen.</li>
	<li>Einsatz Hand zu unterstützen und sichern die Zunge mit dem Laryngoskop gegen die Ratte &#39; s Unterkiefer und visualisieren die Luftröhre und Speiseröhre des Tieres. Die Luftröhre öffnen und schließen, wie die Ratte atmet.</li>
	<li>Legen Sie der Katheter mit einem 20-stumpf-Nadel, im Schritt 1.1, in der Luftröhre vorbereitet. Möglicherweise gibt es leichter Widerstand, und Einfügen in Luftröhre möglicherweise &#34; holprigen &#34; aufgrund der Katheter die trachealen Knorpel reiben. Aufgrund von Feuchtigkeit oder flache Atmung kann die Luftröhre durch den Kehldeckel abgedeckt werden, die Visualisierung der Luftröhre verhindert. Sanft berühren den Rand des Knorpels Kehldeckel wird dazu führen, dass die Knorpel-Klappe öffnen und entdecken Sie die Luftröhre.</li>
	<li>Entfernen die stumpf-Nadel vom Katheter und gleichzeitig des Katheters in der Luftröhre bleibt.</li>
	<li>Warten Sie ein paar Sekunden übergeben für Ratte, um Katheter in Luftröhre atmen zu können.</li>
	<li>Sitz fest den Luftröhre Indikator auf den Katheter zu öffnen. Bewegung der Aerosol-Schranke zeigt der Katheter korrekt in die Luftröhre eingefügt wird.</li>
	<li>Sorgen dafür, dass die Ratte auf die Intubation Stand verlegen, so dass die Brust des Tieres senkrecht zur Ebene der Intubation Stand steht.</li>
	<li>Entfernen den Luftröhre-Indikator und liefern 100 µL (10 7 KBE) des Inokulums mit F. Tularensis mit einer 200 µL Pipettenspitze, fest sitzen die Spitze gegen den Katheter öffnen.</li>
	<li>Legen eine 1 mL Slip Tipp-Tuberkulin-Spritze mit Luft gefüllt und liefern 300 µL der Luft darauf Inokulum erreicht die Lungen der Ratte.</li>
	<li>Den Katheter aus der Luftröhre entfernen, und entfernen Sie die Ratte von der chirurgischen Plattform.</li>
	<li>Ermöglichen die Ratte zu wecken und zurück in den Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Atmung normalisiert hat.</li>
	<li>Bestimmen die KBE in F. tularensis Inokulum wie in Schritt 1.3.5 bestätigen die KBE beschrieben geliefert in der Luftröhre.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.9 auf ungeimpfte (naive) Tiere mit 100 µL PBS anstelle das Inokulum.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Die Fischer 344 Ratte gewinnt ein wichtiges Modell für Tularämie Impfstoff Entwicklung3. Exposition gegenüber F. Tularensis durch die pulmonale Route ist entscheidend für den Nachweis der Wirksamkeit gegen weaponized Form von F. Tularensis, da diese als Aerosole geliefert werden. Intratrachealen Inokulation der Ratte erleichtert gegenüber F. Tularensis ohne die Notwendigkeit für große, teure und komplizierte Aerosol erzeugt Ausrüstung der Ratte Lunge. Alle Versuc...

F. Tularensis (Ft) bewirkt, dass die menschliche Krankheit, Tularämie. Wenn die Bakterien durch die pulmonale Route gekauft werden, führt dies zu Lungenpest Tularämie, die hohe Morbidität und Mortalität1hat. F. Tularensis gilt einen Biothreat Agent wegen der Gefahr Aerosol Formen zugeordnet, und gibt es derzeit keinen Impfstoff für den menschlichen Gebrauch in den USA zugelassen Eine intensive Anstrengung wird derzeit an der Entwicklung von Impfstoffen und therapeutische Maßnahmen gegen Lungenpest Tularämie, zum Schutz der menschlichen Bevölkerung gegen die unerlaubte Nutzung von dieser bakteriellen Biothreat.
Großteil der Tularämie Forschung konzentriert sich auf die Maus-Modell, aufgrund der extremen Empfindlichkeit der Mäuse, F. Tularensis Infektion und der Prävalenz von Reagenzien. Aber erwiesen Mäuse sich ein schwer Modell für die Impfstoffentwicklung, wegen der Schwierigkeit der Impfstoff Wirksamkeit in diesem Modell2. Vor kurzem wurde die Fischer 344 Ratte als Modell für die Tularämie Impfstoff Entwicklung3entwickelt. Die Empfindlichkeit der Fischer 344 Ratte zu verschiedenen F. Tularensis Unterarten imitiert menschliche Sensibilität4, und Ratten geschützt werden können gegen F. Tularensis pulmonale Herausforderung durch Impfung mit einem Lebendimpfstoff Stamm bekannt, um zu schützen Menschen5,6,7. Da die Fischer 344 Ratte einige Features von F. Tularensis Infektion des Menschen modelliert, es möglicherweise ein äußerst nützliches Modell für die Entwicklung eines Impfstoffs, der gegen pulmonale F. Tularensis schützt Exposition.
Ein wirksamer Impfstoff muss zum Schutz der Menschen gegen pulmonale Exposition gegenüber F. Tularensis. Die wahrscheinlichste pulmonale Belichtung von weaponized F. Tularensis wäre Aerosol Bakterien in der Lunge8eingeatmet. Allerdings Aerosolerzeugung von F. Tularensis ist gefährlich und mühsam und erfordert eine spezielle Ausrüstung und Containment. Eine Alternative Route der pulmonalen Exposition bei der Ratte, das vielleicht mehr anpassungsfähig für mehrere Labore spezialisierten Ausrüstung fehlt über intratrachealen Impfung6. Diese Technik nutzt ein Laryngoskop für die korrekte Platzierung des Katheters in die Luftröhre von einem narkotisierten Ratte. Platzierung in der Trachea, anstatt der Speiseröhre wird durch ein einfaches Gerät überprüft, das Luftstrom aus der Lunge visualisiert. F. Tularensis erfolgt anschließend in die Lunge durch den Katheter durch Verwaltung mit einer Spritze, gefolgt von der Einführung der Luft in den Katheter, pulmonale Lieferung der Bakterien zu gewährleisten. Hingegen wird Jemski5 zuvor berichtet, dass F. Tularensis geimpft in Fischer 344 Ratten über die intranasale Route nicht von der Lunge bis 3 Tage nach dem Beimpfen kultiviert werden könnte, darauf hinweist, dass intranasale Impfung bei Ratten kein Resultat in Direktlieferung von Bakterien in die Lunge.
Wählen Sie Agent erfordern F. Tularensis (F. Tularensis Subspecies Tularensis, F. Tularensis Subspecies Holarctica) Biosafety Level 3 (BSL3) Containment Verfahren, die Videografie verhindern würde. F. Novicida (Fn) ist jedoch von select Agent-Status aufgrund seiner Avirulenz bei gesunden Menschen befreit, und sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen9,10genutzt werden. Darüber hinaus dient die Fn als Grundlage für die abgeschwächte Lebendimpfstoffe, die gegen F. Tularensis pulmonale Exposition im Auslieferungszustand über intratrachealen Impfung11,12,13schützen können. Die hier vorgestellten Technik ermöglicht die Studie von Infektionen, die durch die pulmonale Route nutzen Ratten als ein Modell für den Menschen auftreten. Diese Technik kann ohne die Notwendigkeit für Aerosol erzeugen Spezialgerät durchgeführt werden. FN diente die Techniken, die hier gedreht.

<table width="1062">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:376px;height:40px;">GreenLine fiber optic blade size 0</td>
			<td style="width:175px;">Carefusion</td>
			<td style="width:344px;">5-5231-00</td>
			<td style="width:167px;">Macintosh American profile</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GreenLight system laryngoscope handle</td>
			<td>Carefusion</td>
			<td>4559GSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Exel International Safelet I.V. Catheter</td>
			<td>EXEL INTERNATIONAL</td>
			<td>26743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Broad Point Dressing Thumb Forceps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>76-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200ul barrier tip</td>
			<td>GeneseeScientific</td>
			<td>24-142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000ul pipette tip</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>24-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>3000228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>RIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Butler Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent anesthesia machine</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td>VTC302 Classic T3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rodent Anesthesia chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>AB 1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

Pulmonale Infektion mit dem Bakterium Francisella Tularensis kann zu schwere und potenziell tödliche Krankheit, Tularämie, beim Menschen führen. Aufgrund der gegenwärtige Mangel einer genehmigten Tularämie-Impfstoff für den Menschen ist Impfstoffentwicklung unter Verwendung geeigneter Tiermodelle Forschungsschwerpunkt. Fischer 344 Ratte hat ein Modell entwickelt, die menschlichen Infektanfälligkeit F. Tularensis widerspiegelt, und somit ist ein attraktives Modell für die Impfstoffentwicklung Tularämie. Intratrachealen Inokulation der Fischer 344 Ratte mit F. Tularensis imitiert pulmonale Exposition beim Menschen. Die erfolgreiche Zustellung in der Ratte Luftröhre ist entscheidend für pulmonale Lieferung. Ein Laryngoskop mit Beleuchtung wird verwendet, um richtig die Tracheen anästhesierten Ratten Intubation; ein einfaches Gerät bestimmt die richtige Platzierung innerhalb der Luftröhre, Atmung zu erkennen. Nach Intubation wird F. Tularensis Kultur in eine gemessene Dosis per Spritze geliefert. Diese Technik standardisiert pulmonale Lieferung von F. Tularensis innerhalb der Ratte Luftröhre, Impfstoffwirksamkeit zu bewerten.

Die humorale Antwort auf intratrachealen Inokulation von F. Tularensis bei der Ratte durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) gegen UV-inaktiviert Bakterien ermittelt werden wie oben beschrieben11. Insgesamt Immunglobulin G (IgG) Fischer 344 Ratten, inaktiviert, ganze Zelle Bakterien reagierten bewerteten Post-intratrachealen Impfung mit einem abgeschwächten Stamm von Fn (107 KBE Inokulum) an Tag 14 und Tag 28 (A...

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Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Dieses Protokoll beschreibt intratrachealen Impfungen von Fischer 344 Ratten mit Francisella Tularensis. Dieses Verfahren ahmt pulmonale Exposition von Menschen gegenüber dieser potenziellen Biothreat Agent und kann zum Testen Impfstoff und therapeutische Wirksamkeit gegen pulmonale Tularämie verwendet werden.

Intratrachealen Inokulation von Fischer 344 Ratten mit Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K Aufrufe.  University of Texas San Antonio. Dieses Protokoll beschreibt intratrachealen Impfungen von Fischer 344 Ratten mit Francisella Tularensis. Dieses Verfahren ahmt pulmonale Exposition von Menschen gegenüber dieser potenziellen Biothreat Agent und kann zum Testen Impfstoff und therapeutische Wirksamkeit gegen pulmonale Tularämie verwendet werden.

Serie: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel therapeutic entity in reconstructive surgery. However, long term high-dose multi-drug immunosuppressive therapy is required to ensure graft survival, bearing the risk of serious side effects which halters broader application. Further progression in this field may depend on better understanding of basic immunology and ischemia reperfusion injury in composite tissue grafts.
To date, orthotopic hind limb transplantation in rats has been the preferred rodent model for reconstructive transplantation (RT), however, it is an extremely demanding procedure that requires extraordinary microsurgical skills for reattachment of vasculature, bones, muscles and nerves.
We have introduced the vascular cuff anastomosis technique to this model, providing a rapid and reliable approach to rat hind limb transplantation. This technique simplifies and shortens the surgical procedure and enables surgeons with basic microsurgical experience to successfully perform the operation with high survival and low complication rates. The technique seems to be well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury (IRI) studies.

Here we describe the orthotopic rat hind-limb transplantation procedure, which seems to be the gold standard in vivo model for composite tissue allotransplantation research.

Orthotopen Hind-Limb Transplantation in Ratten

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

Protokolle für Vaginal Inokulation und Probenahme in der Experimental-Maus-Modell der Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...