This work was supported by AI101263 from the National Institutes of Health (T.V.B), and by a grant from The Hartwell Foundation (M.L.M). M.L.M. is a member of the Duke Comprehensive Cancer Center.

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren, die die Verwendung von Ratten wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Duke University genehmigt wurde. 1. Vorbereitung der Intubation Kanüle <ol><li> Schneiden Sie die Nadel Ende einer 2-Zoll-14 G angiocathether Nadel mit einer Zange. </li><li> Klemmen Sie das Lumen der Nadel geschlossen mit einer Spitzzange. </li><li> Schneiden Sie den Abschnitt eingeklemmt an den Rand des offenen Lumens Teil mit einer Zange, und dann schneiden Sie die Kanten auf beiden Seiten des verbleibenden Ende bei 30 - 45 ° Winkel zur Nadel Rand. </li><li> Legen Sie die unteren 3-4 mm der Kanüle in den offenen Bereich des Straight-Schiebe-Zange und nach oben ziehen, bis eine leichte Aufwärtskurve am Ende gebildet. Hinweis: das Lenken des Katheters in der Luftröhre (1) zu erleichtern. </li><li> Verwenden feinem Sandpapier, um am Ende der Kanüle glätten Sie die Kanten. </li><li&gt; Bringen Sie den abgestumpften Instrument in die Angiokatheter Schläuche. Sicherzustellen, dass der Schlauch ist etwas kürzer als die stumpfe Nadel. </li></ol> 2. Pre-chirurgische Verfahren <ol><li> Richten Sie die Website für die Prozedur, indem ein Operationsmikroskop zu 10-facher Vergrößerung über den Betriebsbereich eingestellt. </li><li> Legen Sie eine wärmende Unterlage auf den Arbeitsbereich und mit einem sauberen absorbierenden Pad. </li><li> Richten Sie eine Herzfrequenz und Blutsauerstoffsensors in das Operationsfeld. </li><li> Wiegen Sie die Ratte für gewichtsbasierte Dosierung von Medikamenten (zB postoperative Analgesie, Antibiotika oder Lymphozyten-abbauende Antikörper). HINWEIS: Typische erwachsenen Ratten wiegen zwischen 350 bis 450 g. </li><li> Sedate die Ratte mit verdampften 3% Isofluran-O &amp; sub2; (3 l / min) unter Verwendung einer Induktionskammer entlüftet, um einen Abfallanästhesiegas System Aktivkohle enthält. Lassen Sie 5 Minuten für die Narkoseeinleitung zu tiefe Narkose für Intubation erforderlich sind. </li><li> Verabreichen Carprofen oder Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutan in die Ratte vor der Anwendung mit Intubation und Operation fortfahren. </li><li> Verwenden elektrischen Haarschneider, um den Hals und Brust des narkotisierten Ratten vor der Intubation zu rasieren. </li></ol> 3. Intubation <ol><li> Bereiten Sie die Intubation Setup durch Reiben einer kleinen Menge von Schmier (zB KY Gel) auf das Ende des Intubationskanüle. Drehen an dem Beatmungsgerät, um den Fluß von Isofluran Gas durch die Rohrverbinder beginnen. </li><li> Übertragen der Ratte zur Intubation Vorrichtung und die Ratte an der Metallleiste zu suspendieren mit seinem oberen Schneidezähne (2A). ANMERKUNG: Bestimmte Intubation Vorrichtungen können online erworben werden. Die hier gezeigte Modell ist mit einer Acrylplatte um Abschnitte einer 2 x 4 Zoll Lendenstück mit einer Butanbrenner Formhausgemacht, und Verstärkungen mit Chloroform befestigt. Die Bar (oder Metalldraht) wird durch Bohren von Löchern über Kreppband an der s an diesem befestigtide der Acryl zu Absplitterungen oder Risse zu verhindern. </li><li> Trans beleuchten Nacken der Ratte, indem eine flexible hochintensive Lichtquelle 1-2 cm von der Bauchseite des Halses (2B). </li><li> Verwenden Sie ein Paar Studenten Standardmuster einer Pinzette, um die Zunge leicht nach oben und an der Seite der unteren Zähne zu ziehen. Fassen Sie die Lasche zwischen Daumen und Zeigefinger einer Hand beim Aufsetzen der flachen Innenfläche der einen Seite der Zange gegen das untere Ende der Zunge. Press ventral den Kehldeckel und der Öffnung des Kehlkopfs (2C) zu belichten. </li><li> Visualisieren Sie die Stimmbänder und führen die umgedrehten, abgestumpft Ende des Intubationskanüle nach vorn durch die offene Stimmritze in die Luftröhre, bis die Nabe des Angiokatheter berührt die Schneidezähne. </li><li> Entfernen Sie die Metallführungsstab, und befestigen Sie den Schlauch mit dem Narkose Angiokatheter Öffnung zur Belüftung mit Isofluran beginnen. HINWEIS: Die typische Sauerstoff flow Rate an das Beatmungsgerät 3 L / min mit 3% Isofluran. <ol><li> Gesetzt den Ventilator mit einer Geschwindigkeit von 60 Atemzügen / min in einem Volumen gesteuert Beatmungsmodus, der einen Druck von ~ 12 erreicht - 14 mmHg. Verwenden Sie einen positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 3 cm H 2 O. </li></ol></li><li> Beobachten bilateralen Brustwand Expansion synchron mit dem Beatmungsgerät, um eine ordnungsgemäße Plazierung des Endotrachealtubus zu gewährleisten. </li><li> Bewerben Tierarzt empfohlenen Augensalbe die Augen der Ratte zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. </li><li> Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen der Ratte zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. </li><li> Sichern Sie den Tubus auf den Kopf der Ratte mit einem Streifen aus Gewebeband. Achten Sie darauf, eine feste Verbindung zwischen dem Endotrachealtubus und dem Narkose Zufluss Schläuche. </li><li> Befestigen Sie die Sauerstoffsättigung des Blutes und Herzfrequenz-Messgerät bis zu den Füßen der Ratte und beginnen Überwachung. Überprüfen Sie die Betäubung durch die Bestätigung erfolgt keine Reaktion aufE-Prise. </li></ol> 4. Thorakotomie und Thymektomie <ol><li> Folgen Sie der üblichen aseptischen Technik für die Gesamtheit des Verfahrens. <ol><li> Reinigen Sie den Arbeitsbereich und Operationstisch und desinfizieren mit einer 70% igen Ethanollösung. </li><li> Verwenden Sie sterile Handschuhe während des Verfahrens, und Autoklaven alle Instrumente und Materialien während des Verfahrens verwendet. </li><li> Bewerben Providon-Jod auf die gesamte Brustbereich und lassen Sie ihn trocknen. Danach die Oberfläche der Haut mit 70% Ethanol auf Gaze. Decken Sie die Ratte mit Klarsichtfolie ein Loch, um das sterile Operationsfeld freizulegen. </li></ol></li><li> Identifizieren Sie die Jugulum im oberen Brustbereich. Machen Sie eine 2 cm Mittelschnitt durch die Haut ab 2-3 mm über dem Jugulum und sich distal Mittellinie entlang des Brustbeins mit stumpfen Shea Schere. </li><li> Führen Sie einen 1,5 cm Längssternotomie vom Jugulum wieder mit stumpfen Shea Schere. KEEP die Unterkante der Schere direkt unter dem Brustbein und Fortschritt langsam. </li><li> Legen Sie einen kleinen Alm Aufroller knapp unterhalb des Brustbeins getrennt und offen für die Pre-Luftröhrenhalsmuskulatur (M. sternohyoideus und M. sternothyroideus Muskeln) zu offenbaren. Trennen Sie die Pre-Luftröhrenhalsmuskulatur mit stumpfen Graefe Pinzette. HINWEIS: An diesem Punkt kann der Trachea zu sehen ist, und der Intubationstubus sollte innerhalb der Luftröhre sichtbar gemacht werden. </li><li> Legen Sie die Zinken des kleinen Alm Aufroller unter den getrennt Halsmuskulatur und Brustbein. Öffnen Sie die Rückziehvorrichtung, die überlegene Aspekt der Thymus aus. </li><li> Verwenden feinen Pinzette Dumont, um die Seitenränder des Thymusgewebe lösen und setzen die unteren Thymus Lappen. </li><li> Ziehen Sie den Thymus sanft souverän ins Freie Inzisionsstelle, kümmert sich um den Kontakt mit der oberen Hohlvene, subclavia und Halsgefäße zu vermeiden und zu einer Störung der empfindlichen Brustfellfutter zwischen dem Thymus und Lunge zu minimieren. </li><li> Da ter Thymus Gefäße präpariert und aufgedeckt, verwenden Mikro-Scheren, um sie zu teilen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Druck auf die Gefäße zur Blutstillung zu halten, wenn nötig. </li><li> Liefern Sie die unteren Lappen des Thymus in den Einschnitt und dann scharf lysieren die hinteren Anbaugeräte. Entfernen Sie die intakten Thymus und sorgfältig inspizieren entfernt Thymus nach fehlenden Abschnitte. HINWEIS: Kleine Brust-Lymphknoten rund um den Thymus sichtbar gemacht werden und sind oft nur schwer von Thymusgewebe unterscheiden. Diese werden diskrete runde Knoten mit einer ähnlichen Erscheinung Thymusgewebe, wird jedoch nicht in Kontinuität mit der Thymus sein. </li><li> Entfernen Sie die Alm Aufroller und schließen Sie die M. sternohyoideus und sternothyoid Muskeln mit zwei unterbrochen 5-0 Maxon Nähten. </li><li> 2 Tropfen von chirurgischer Qualität Cyanoacrylatkleber über die Nähte, die Mediastinum unter Überdruckbeatmung zu versiegeln. Hinweis: das wird die Häufigkeit von Pneumothorax und Hämatome zu verringern. </li><li> Schließen Sie die sternum mit zwei unterbrochen 4-0 Seidenfäden auf ein Schneide Nadel. Führen Sie die Nadel durch die Lücken zwischen den Rippen, kümmert sich um die Nadel direkt unter dem Brustbein zu führen, um die darunter liegende Muskelschicht zu vermeiden. </li><li> Schließen Sie die Hautschicht mit einer Lauf 4-0 Nylonnaht. Unterbrechen Sie die Isofluran an dieser Stelle auf die postoperative Anästhesie Erholungszeit zu verkürzen. </li><li> Reinigen Sie die Inzisionsstelle und der umgebenden Haut mit Kochsalzlösung angefeuchtet Gaze. </li><li> Mehrere Tropfen Bupivicain (0,25%) zur Lokalanästhesie, gefolgt von 1-2 Tropfen Sekundenkleber auf den Schnitt, um den Einschnitt zu versiegeln. </li><li> Weiter zu belüften, bis die Ratte Anzeichen von unabhängigen Atemanstrengung und fängt an, seine Gliedmaßen zu bewegen. Extubieren die Ratte und lassen Sie ihn unter Beobachtung in einem Käfig auf eine wärmende Unterlage platziert erholen. </li><li> Verwalten Buprenorphin (0,01 bis 0,05 mg / kg) subkutan in die Ratte unmittelbar nach der Operation, und wiederholen Sie alle 8-12 h 48 h post operativ (in der Regel 5 Gesamtdosen). Nach 24 und 48 Stunden nach der Operation, Administration Carprofen oder Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutan (3 Gesamtdosen einschließlich der präoperativen Dosis). </li><li> Weiter zu überwachen, bis die Ratte um den Käfig zu bewegen. Bei Anzeichen von Atemnot, führen Sie Re-Intubation und Wieder Erforschung der Brust. <ol><li> Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Hautschicht Nähte 1 Woche nach der Operation. </li></ol>

<ol>
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Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).</li><li>Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+endotracheal+intubation+in+the+rat.">A simplified method for endotracheal intubation in the rat.</a> J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).</li><li>Jou, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+rat+intubation+using+a+new+oropharyngeal+intubation+wedge.">Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge.</a> J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).</li><li>Rivard, A. 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Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+surgery:+removal+of+the+spleen+or+thymus.">Survival surgery: removal of the spleen or thymus.</a> Curr. Protoc. 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Transplant.</a> Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).</li><li>Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary,+but+Essential+Requirement+of+CD8++T+Cells+Early+in+the+Pathogenesis+of+Diabetes+in+BB+Rats+as+Revealed+by+Thymectomy+and+CD8+Depletion.">Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion.</a> Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die vorliegende Protokoll für die komplette Thymektomie eine minimal-invasive Ansatz mit einem Drei-Schicht Einschnitt Verschluss mit chirurgischen Klebstoff Anwendung entwickelt, um Komplikationen zu minimieren. Die vollständige Entfernung des Thymus wurde durch den Verlust von naiven T-Zellen und durch IHC Färbung mediastinaler Lymphgewebe Zytokeratin demonstriert. 20% aufgrund von perioperativen Komplikationen, von denen die meisten der auf die enge Verbindung der unteren Lappen des Th...

Seit den frühen 1960er Jahren hat sich die Thymusdrüse für seine entscheidende Rolle in der Entwicklung der zentralen immunologische Toleranz anerkannt. Nagetier thymectomy hat sich als ein wesentlicher Vorgang bei der Definition der Rolle von Thymus der Lymphozytendifferenzierung Selbsttoleranz und Immuntoleranz in der Einstellung der Allograft Transplantation und Tumormetastasen. Die Entfernung der Ratte Thymus ermöglicht Studien mit T-Zell-Depletion oder adoptiven Transfer von definierten T-Zellpopulationen, ohne das erneute Auftreten von einheimischen naiven T-Zellen. Thymectomies bei neugeborenen Nagetieren können mit einem Saug-Technik mit zuverlässigen Ergebnissen 1 durchgeführt werden. In erwachsenen Ratten wird diese Technik mit einer ungefähren 20% Todesrate und führt häufig zu einer unvollständigen thymectomy 2. Um eine vollständige Thymektomie bei erwachsenen Ratten durchgängig zu erreichen, ist offen Belichtung des Mediastinum über eine mediane Sternotomie erforderlich. Doch diese6% 2- 4 - Verfahren ist mit Komplikationen, die Trachea Verletzungen, Blutungen und Pneumothorax, die zu einer Gesamtmortalität von 1,5 sind verbunden. In den letzten zwei Jahrzehnten Verbesserungen thymectomy Techniken perioperativen Komplikationen vermindert und wurden Überlebensraten verbessert. Intubation so dass für Überdruckbeatmung hat Pneumothorax Raten 5 verringert. Methoden der Intubation zuvor aus offenen Exposition beschriebenen Bereich um die Luftröhre zu weniger invasiven Methoden mit direkter Stimmband Visualisierung. Komplikationen im Zusammenhang mit der Intubation Verfahren verbunden sind Luftröhrenverletzung, Stimmbandbruch, unbeabsichtigte Speiseröhre Intubation und Blutungen aus Herzpunktion oder Zerstörung von der oberen Hohlvene resultieren. Außerdem kann die Nähe der unteren thymic Keulen pleuralen Auskleidung Pneumothorax führen. Hier beschreiben wir eine TechnikThymektomie durch eine minimal-invasive 2 cm Hautschnitt nach einer einfachen Methode der Intubation mit einem stumpfen Ende Angiokatheter und transkutane Luftröhrenbeleuchtung. Die thymectomy beinhaltet eine 1,5 cm Sternotomie und einen dreischichtigen Verschluß mit chirurgischen Leimauftrag auf das Mediastinum abzudichten und die Inzidenz von Blutungen und respiratorische Komplikationen zu minimieren. Dieses Verfahren zuverlässig entsteht lücken thymectomy wie durch das Verschwinden der CD4 + und CD8 + T-Zellen naive folgenden thymectomy und Abwesenheit von Thymusgewebe auf IHC Färbung nachgewiesen. Operative Zeiten und peri-prozedurale Sterblichkeit sind auf ein Minimum reduziert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="718">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">2&#34; 14-gauge angiocatheter</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:117px;">Zeiss</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Warming pad</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors</td>
			<td style="width:117px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:152px;">ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;">See Figure 2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:283px;">Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank</td>
			<td style="width:117px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:152px;">ST1 72-6420</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:283px;">Small animal ventilator with tubing</td>
			<td style="width:117px;">CWE</td>
			<td style="width:152px;">12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High-intensity Fiber-Optic Illuminator</td>
			<td style="width:117px;">Dolan Jenner</td>
			<td style="width:152px;">EEG 2823M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Student standard pattern forceps</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">91100-16</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Fine straight scissors</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Blunt-tipped Shea scissors</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">14105-12</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Small Alm retractor (for sternum)</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">17008-07</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Blunt Graefe forceps</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">11050-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Fine Dumont forceps</td>
			<td style="width:117px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:152px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">5-0 Maxon sutures</td>
			<td style="width:117px;">Ethicon</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">4-0 Silk sutures (with cutting needle)</td>
			<td style="width:117px;">Ethicon</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">6-0 Nylon suture</td>
			<td style="width:117px;">Ethicon</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cyanoacrylate glue (Endermil)</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Lubrication gel</td>
			<td style="width:117px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:152px;">NDC 17478-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete thymectomy in adult rats with non-invasive endotracheal intubation

Thymektomie bei neugeborenen Nagern ist ein etabliertes und zuverlässiges Verfahren für immunologische Untersuchungen. Doch bei erwachsenen Ratten, Komplikationen von Blutungen und Pneumothorax von pleural Unterbrechung kann zu einer signifikanten Sterblichkeit führen. Dieses Protokoll ist ein einfaches Verfahren zur Ratte thymectomy, die einen Mini-Sternotomie Intubation verwendet. Intubation ist mit einer nicht-invasiv und leicht reproduzierbares Verfahren erfolgen und ermöglicht positive Druckventilation Pneumothorax zu verhindern und eine gesteuerte Luftwege, die ausreichende Zeit für eine sorgfältige Dissektion Thymus pleurale Minimierung von Störungen ermöglicht. Ein 1,5 cm Brustbeineinschnitt nimmt Kontakt mit mediastinale Gefäße und Rippenfell, während immer noch eine vollständige Visualisierung des Thymus. Nach der Belichtung des Mediastinums wird der Thymus stumpf unter Vergrößerung entfernt. Pleuraraum wird dann durch Nahtverschluss der vorge tracheale Muskeln, gefolgt von der Anwendung des chirurgischen Klebstoff abgedichtet. DieBrustkorb wird dann durch Nahtverschluss des Brustbeins, gefolgt von Nahtverschluss der Haut verschlossen. Alle thymectomies abgeschlossen waren, wie durch immunhistochemische (IHC) Färbung der mediastinalen Gewebe und Abwesenheit von naiven T-Zellen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie, und das Verfahren war eine 96% ige Überlebensrate. Diese Methode eignet sich, wenn Sie fertig Thymektomie mit minimalen Komplikationen für weitere immunologische Untersuchungen in athymischen erwachsenen Ratten gewünscht.

Dieses Verfahren wurde zur Erwachsenen Lewis-Ratten (n = 26) durchgeführt. Die mittlere Operationszeit betrug 15 ± 3 min. Es gab keine intraoperative Mortalität. Die mittlere Intubation Zeit - von Platzierung von Ratten auf der Intubation Gerät zur Gründung der Belüftung - betrug 45 ± 5 sec. 24 Ratten hatten eine vollständige Genesung von der Operation ohne Anzeichen von Atembeschwerden oder Blutungen durch postoperativen Tag (POD) 14. Eine Ratte entwickelten Atemnot auf POD 4 und unterzog Re-Operation, um das M...

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Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

complete-thymectomy-adult-rats-with-non-invasive-endotracheal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described. 

Serie: Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Nicht-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Zusammenfassung

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Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Nicht-invasiv

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen