Tamara Zeric für die Hilfe, das multiphoton Bild in diesem Papier zu erhalten. Durch das Gehirn & Verhalten, Parkinson und JPB Stiftungen, R01 MH108186 und R01 DA07418 unterstützt. F31-Stipendium 1F31MH109293-01A1 S c.

Alle Verfahren, die mit Tieren nach den Standards durchgeführt wurden festgelegt durch die Columbia University Medical Center institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Euthanasie erfolgte durch zervikale Dislokation in Narkose mit Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg intraperitoneal injiziert. Alle chirurgischen Eingriffe wurden in einer sterilen Weise durchgeführt (Chirurg trug Kopf Kappe, Gesichtsmaske, sterile Handschuhe und sauber Einweg Kittel) und chirurgische Instrumente wurden zwischen jedem Gebrauch autoklaviert.
(1) präoperativen Schritte
<ol><li>Autoklav alle chirurgischen Instrumente, um Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>C57bl6 Mäuse mit Isofluran (4 % für die Induktion und 1,5-2 % für die Chirurgie) zu betäuben. Kneifen Sie die Hinterbeine Zehe alle 10 Minuten, um richtige Tiefe der Narkose zu gewährleisten. Anästhesie zu erhöhen, wenn Vokalisation oder hinteren Gliedmaßen einfahren gesehen wird.</li>
	<li>Wenden Sie tierärztliche Auge Schmiermittel für die Augen austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haare über der Kopfhaut mit einer Anwendung von 3 min Entfernung Haargel oder durch Rasur mit einem Elektrorasierer.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen oder eine kalibrierte Wasser rezirkulierenden Decke legen Sie auf 38° C.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zur präoperativen Analgesie zur Verfügung zu stellen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei wechselnden Anwendungen von Chlorhexidin oder Betadine und 70 % Ethanol mit einem Baumwolle Applikator gekippt.</li>
	<li>100 mL Bupivacain verdünnt 50 % Kochsalzlösung unter der Kopfhaut zu örtlicher Betäubung zu injizieren.</li>
</ol>(2) piezoelektrischen kranialen Fenster Chirurgie
<ol><li>Mit autoklaviert sterilen chirurgischen Instrumenten, entfernen Sie einen 1 cm Kreis der Kopfhaut über den Schädel durch Schneiden mit einer chirurgischen Schere in einem kreisförmigen Muster. Heben Sie die Kopfhaut aus der Schädel auszusetzen das Periost Gewebe über den Knochen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Spitze der Zange um die freiliegenden Knochen frei von jeder verbleibende Periost Gewebe reiben. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass der dental Zement nicht später fallen wird.</li>
	<li>Stellen Sie die piezoelektrischen Chirurgie-Einheit auf der niedrigsten Stufe zu vibrieren. Beachten Sie, dass höhere Einstellungen Blutgefäße durch intensive Vibrationen brechen können.</li>
	<li>Die sterile Runde Spitze auf das Handstück zu beheben. Hinweis: Die 4 mm Runde Spitze eignet sich gut für Operationen. Die große Spitzengröße trägt zur Geschwindigkeit der Operation wie das gesamte Fenster gleichzeitig verdünnt werden kann.</li>
	<li>Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit Eis kalt künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) und halten Sie ihn in die Hand, die nicht das piezoelektrische Handstück.</li>
	<li>Den Schädel von tropft der ACFS aus der Spritze auf den Schädel mit einer Rate von 1 mL/min. Alternativ zu bewässern, verwenden einer peristaltischen Pumpe positioniert über den Schädel, um die Verwendung der anderen Hand zu befreien. Hinweis: Bewässerung mit kalten ACFS ist wichtig, eine Überhitzung aufgrund der Reibung von der hochfrequente Schwingungen zu vermeiden.</li>
	<li>Tragen Sie sanft vibrierenden chirurgische Tipp an den Schädel mit leichten kreisenden Bewegungen (3 Kreise pro 1 s) und dünnen Knochen auf die gewünschte Tiefe eine dünne Schädel-Vorbereitung (5-10 min) durchführen. Hinweis: Hier wurden 4 mm Fenster gefertigt, die bis 20 µm ausgedünnt wurden. Allerdings variiert die Größe des Fensters mit der Größe der chirurgischen Spitze. Die Stärke des Knochens kann auf die gewünschte Tiefe basierend auf der Länge der Zeitaufwand bei der Anwendung der Tipp mit dem Schädel angepasst werden.</li>
	<li>Sanft einstellen Sie den Winkel des Handstücks und ändern Sie den Winkel der Spitze beim Druck auf den Schädel, den Schädel gleichmäßig dünn.</li>
	<li>Um eine komplette Knochenentfernung durchzuführen ohne jede dünne Knochen hinter, dünne Knochen bis Risse um die Fensterfläche sichtbar sind. Entfernen Sie die restlichen Flocken von dünnen Knochen ohne Beschädigung der zugrunde liegenden Dura mit Zange.</li>
	<li>Ein 1 mm Stück Schaumstoff blutstillende Kollagen in kalten ACFS einweichen. Halten Sie den nassen Schaum mit Zange und legen Sie es auf die dünne Schädel. Lassen Sie ihn sitzen auf dem dünnen Schädel für ca. 30 s, jede Mikro zu stoppen blutet aus den Entwicklungsländern.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange, ein 4 mm Glas Deckglas seitlich über dem Fenster platzieren, der in den Knochen ausgedünnt wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie die Rückseite ein kleiner aus Holz oder Plastik Baumwolle Applikator gekippt ca. 100 µL zahnärztliche Acryl auf den Schädel um das Fenster zu fixieren anwenden.</li>
</ol>3. post OP Pflege
<ol><li>Entfernen Sie die Maus aus dem chirurgischen Gerät und legen Sie sie in einem beheizten Käfig für die Wiederherstellung. Überwachen sie kontinuierlich, bis es volle Bewusstsein (durch normale Beweglichkeit, Gang und Verhalten bewertet) wiedererlangt hat.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Tiere zweimal täglich für drei Tage für Manifestationen der Schmerzen nach der Operation einschließlich verminderte Aktivität, Pflege, Ernährung und Wasserverbrauch, bewachen Verhalten (z. B. hinken oder ein Buckliger Haltung) oder erhöhte Aggression. Das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt hat.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin (0,05 – 0,1 mg/kg) subkutan als eine analgetische 8 – 12 h nach der Operation für 3 Tage. Überwachen Sie den Bereich des Fensters eng nach der Operation für Dehiszenz, Entzündungen und Anzeichen einer Infektion. Wenn das Tier nicht zu Baseline Fütterung und Pflege Verhaltensweisen zurück, konsultieren Sie einen Tierarzt bezüglich etwaiger Interventionen oder Euthanasie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

Gibt es keine Angaben.

Die Operation kann durch Ändern der chirurgischen Spitze geändert werden. Es gibt viele verschiedene Größen der Spitze, die das Handstück angewendet werden können. Ändern der Größe oder Form der Spitze wird in verschieden große Fenster führen. Neben den 4 mm-Tipp wir auch versucht eine 3 mm Spitze und fand es auch gut funktioniert. Auch bei Bewässerung mit Eis kalt ACFS konnten wir nicht bekommen gute Ergebnisse mit Tipps, die zu (ca. 0,25 mm) aufgrund der konzentrierten Vibrationen verursacht zu viel Hitze und Brennen des Knochens führt um zu Beschädigung der zugrunde liegenden Dura schmal waren. Wir haben nicht versucht, die Vielzahl der anderen Tipps, die verfügbar sind, und wir erwarten, dass andere Labore können neue Anwendungen für diese verschiedenen Tipps zu finden. Während die Operation relativ einfach ist, fanden wir, dass es gibt mehrere Schritte, die zur Fehlerbehebung benötigen. Die erste ist, dass die vibrierende Spitze viel Turbulenzen in der ACFS die Sichtbarkeit verringert und Schwierigkeiten produziert bei der Ermittlung von Knochen Tiefe während des Knochens dünner Schritt der Operation produziert. Wir empfehlen, wenn es zu schwierig, zu sehen, wie dünn der Knochen ist, machen eine Pause, die Schädel und Fenster trocknen durch die Anwendung einer sterilen Wattetupfer auf die Seite des Knochens. Die Wattestäbchen nicht direkt ans Fenster, anwendbar, da die rauhe Oberfläche dünne Knochen schadet. Nach der Überprüfung der tiefes erneut ACFS und fahren Sie mit der Operation. Wir fanden auch, dass wenn es beschädigt die Dura ist, ist es in der Regel aufgrund der Chirurg zu viel Druck auf die Spitze. Halten das Handstück schonender und weniger Kraftaufwand werden wahrscheinlich dieses Problem zu beheben. Wenn der Chirurg gewaltsam die Spitze auf den Knochen Schaben, wird dazu führen, dass eine Pause in den dünnen Knochen und beschädigen den Schädel. Schließlich erscheint nach Ausdünnung des Knochens, die zugrunde liegenden Dura verletzt, ist es wahrscheinlich durch überschüssige Wärme aus den Schwingungen. Erhöhung der ACFS fließen, um dieses Problem zu beheben.
Die wichtigste Einschränkung der PHASOR ist, dass das Handstück kann den Knochen dünn, aber nicht über die Dura alle Knochen entfernen. Die Diamant beschichteten Spitze hat kleine grobe Unebenheiten. Die Reibung benötigt, um den Schädel zu dünn würde die Dura abzuschleifen und Blutungen, wenn es verwendet wurden, um den Knochen zu entfernen. Somit ist der Einsatz von Zange erforderlich, um die verbleibenden dünnen Schicht zu entfernen. Während es fortwährende Debatte gibt auf ob Bildgebung durch eine dünne Schädel weniger Entzündungen und weniger Verbreitung von Mikroglia und reaktive Astrocyten produziert, in einigen Fällen ist ein Fenster mit keine Knochen verbleibenden bevorzugt, z. B. zu einer größeren Tiefe von imaging-3 .
Wir haben kranialen Fenster Vorbereitung multiphoton Bildgebung bei Mäusen optimiert. PHASOR ist unseres Wissens die erste Anwendung der Piezo-Technik, Nagetier kranialen Fenster Chirurgie für optische Bildgebung. Wir finden, dass die Nutzung der piezoelektrischen Chirurgie bei Mäusen die Vorteile der erhöhten Geschwindigkeit teilt und unerwünschte Ereignisse auch in Menschen7,8,9,10berichtet verringert. Auslastung der piezoelektrische Vorrichtung führte zu schnelleren Operationen (Abbildung 2A) und weniger Nebenwirkungen von Blutungen im Vergleich zu einem High-Speed Rotary bohren (Abb. 2 b). Wir fanden auch in unserem Labor, dass PHASOR einfacher für neue Chirurgen zu erlernen als traditionelle Ansätze zur kranialen Fenster Operation war. Vorteile von Geschwindigkeit und Benutzerfreundlichkeit werden voraussichtlich unter Chirurgen unterscheiden. Dünne Schädel Vorbereitungen erfordern in der Regel 30-45 min, dünne Knochen mit einem Bohrer und Skalpell2, während der PHASOR Ansatz in der Regel weniger als 10 Minuten erfordert.
Wir fanden, dass in Windows vorbereitet mit PHASOR Kalzium Transienten in Schicht 4 pyramidenförmigen Nervenzellen im motorischen Kortex vorstellen könnte, die mit Adeno-associated Virus Codierung des Kalzium-Indikators JRGECO1a transfiziert worden war (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). wir fanden auch, dass im Vergleich zu einem dünnen Schädel kranialen Fenster vorbereitet mit einem rotierenden Bohrer und Skalpell, die bildgebende Region war größer, während eine dünne Schädel mit einem rotierenden Bohrer vorbereitet und Skalpell hat ein imaging-Fenster von 20 µm Durchmesser2 . Mit PHASOR konnten wir schnell eine Fläche von ca. 3-4 mm dünn. Dies ist vergleichbar mit der bildgebenden Fenster mit PoRTS4berichtet. Diese größere Fenster behält den Vorteil der schnellen Bildgebung für dünne Schädel Windows vorbereitet mit einem Zahnbohrer und Skalpell gemeldet. Darüber hinaus kann das Fenster mit PHASOR zubereitet sofort abgebildet, im Gegensatz zu traditionellen Knochenentfernung abgebildet Windows, die Wochen zu heilen, bevor das Fenster optimal sein kann verlangen3.
Diese Technik kann angewendet werden, um Veränderungen des Blutflusses in den Gefäßen unter der Dura zu studieren. Eine wichtige zukünftige Studie soll Immunoreactivity PHASOR mit anderen Methoden der kranialen Fenster zu vergleichen. Dies wäre wichtig, um festzustellen, ob PHASOR weniger Entzündung im Vergleich zu bisherigen Methoden produziert. Wir hoffen, dass die piezoelektrische Operationstechnik, die hier dokumentiert wird mehr Labs kranialen Fenster und Multiphoton in Vivoimaging erfolgreich zu nutzen.
Stellen Sie sicher, dass das Handstück auf die niedrigste Einstellung vibrieren soll und dass der ACFS ist mit einer konstanten Rate bewässert wird. Die eiskalte ACFS ständig angewendet werden muss oder es wird erhitzen und beschädigen die Dura. Wir fanden, dass ACFS muss, mit einer Rate von mindestens 1 mL/min, verwenden Sie entweder eine Spritze in der Hand gehalten angewendet werden, oder verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, anstatt die integrierte Bewässerung im Handstück. Das Bewässerungssystem im Handstück wirft ACFS zu kräftig und produziert zu viel Turbulenzen, die Sicht erheblich beeinträchtigen wird.

Kranialen Fensters Chirurgie zur in-Vivo imaging Multiphoton Nagetiere Vorbereitung ist eine wichtige Technik in den Neurowissenschaften geworden. Die Entfernung oder Ausdünnung der Knochen ist muss man die Maus für die optische Bildgebung mit einem multiphoton Mikroskop vorbereiten. Diese Chirurgie wird durch eine Fläche von Knochen, die zugrunde liegenden Dura1aussetzen vollständig zu entfernen oder durch Ausdünnung einer Region des Knochens ohne vollständige Entfernung von Dura2durchgeführt. Der dünne Schädel-Ansatz kann zu weniger Entzündungen und Aktivierung der Mikroglia3 jedoch bietet eine flachere Schärfentiefe-imaging, imaging eine kleinere Fenstergröße (200 µm) und einen begrenzten Zeitraum, während dessen das Fenster wegen Knochen nachwachsen2 abgebildet werden können . Die Zugabe von einem polierten und verstärkte Glasfenster (PoRTS) kann die bildgebenden Größe und bildgebenden Zeitraum verbessern aber ist schwierig,4durchführen.
High-Speed rotierende Bohrer verwenden beide aktuellen Operationen zu dünn oder entfernen die Knochen aus dem Schädel. Die dünne Schädel-Technik nutzt auch ein Skalpell nach den Bohrer weiter Ausdünnen der Knochen-2. Die PoRTS-Technik erfordert den zusätzlichen Schritt der high-Speed-Polieren mit Körnung4. In einer hohen Geschwindigkeit verursacht rotierende Bohrer, angetriebene Luftturbine oder Elektromotor die Bohrkrone mit hoher Geschwindigkeit drehen. Wie rotierende Bohrer Knochen und Weichgewebe Abschnitt, gibt es ein Risiko der Beschädigung der Dura und zugrunde liegenden Blutgefäße. Der Erfolg der Operation hängt von der Geschicklichkeit des Operateurs. Zusätzlich zu diesen Fenstern mit mechanischen chirurgischen Methoden vorbereitet wurde eine chemische Methode optisch den Schädel mit unterschiedlichen Lösungen entwickelten5,6. Da piezoelektrischen Chirurgie eine mechanische Methode der Operation ist, werden unsere Vergleiche hier jedoch auf andere mechanische Methoden beschränkt werden.
Piezoelektrische chirurgische Geräte nutzen Ultraschallschwingungen zum Abbau von mineralisierten Knochen ohne schädliche zugrunde liegende Weichgewebe und bieten somit einen Ansatz um schnell eine große Fläche des Knochens dünn. In einem piezoelektrischen chirurgischen Handstück die Turbine wird durch einen Stapel von Keramikscheiben ersetzt und wenn Strom angewendet wird, die Scheiben vibrieren bei Ultraschall-Frequenzen. Die Schwingungen werden durch das Handstück zu Diamant beschichtete Spitzen Knochen ohne schädliche Weichteile, einen Vorteil gegenüber rotierenden Bohrer durchschneiden, die nicht zwischen Gewebetypen diskriminieren übertragen. Piezoelektrischen Chirurgie wurde ursprünglich für den Einsatz in der Human-von Tomaso Vercellotti entwickelt und führte zu Verbesserungen in Dental und Cranio-Maxilofacial Chirurgie7,8,9,10,11 .
Piezoelektrischen Chirurgie verwendet wurde, um eine Osteotomie in Wistar Ratten zu schaffen und fand durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) und Histologie, deutlich weniger Schaden als eine traditionelle Zahnbohrer12zu produzieren. Die Autoren folgerten, dass piezoelektrische Chirurgie sicher zum Entfernen des Knochens in der Nähe von weichen Hirngewebe. Mäuse, haben jedoch ein dünner Dura, die leicht beschädigt ist, und diese Studie chronische optische Bildgebung nicht Windows vorbereiten. Chronische Bildgebung erfordert, dass die Blutgefäße nicht beschädigt werden und unter dem Fenster keine Blutgerinnsel bilden. Schädigung der Dura führt zu Entzündungen, die bewirkt, das Fenster dass in die cloud, und aktiviert Mikroglia und die Verbreitung von reaktiven Astrozyten. Hier haben wir piezoelektrischen Chirurgie für Mäuse dünne Schädel und voller Knochen entfernen kranialen Fenster geeignet für chronische Belichtung erstellen optimiert. Wir verglichen diese Operationstechnik zu kranialen Fenster Operationen mit hoher Geschwindigkeit rotierende Bohrer vorbereitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Piezosurgery Touch</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>5120062</td>
			<td>Piezosurgery GP model has the same settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>3370019</td>
			<td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for irrigation.</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-77120-42</td>
			<td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene Ultrafoam</td>
			<td>Bard-Davol</td>
			<td>1050020</td>
			<td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C&#38;B Metabond</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S380</td>
			<td>Much stronger than regular dental acrylic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube opthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>
			<td>UPENN Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

Multiphoton Mikroskopie ist weithin für Neuronen in Vivoimaging angepasst worden. Wiederholte Bildgebung erfordert Implantation eines kranialen Fensters oder wiederholte Verdünnung des Schädels. Kranialen Fensters Operation erfolgt in der Regel mit einem hohen Geschwindigkeit rotierende Bohrer, und viele Forscher finden es schwierig um zu verhindern, dass den Bohrer Beschädigung der empfindlichen Dura und Blutgefäße. Umfangreiche Ausbildung und Praxis ist erforderlich, um den Knochen ohne Beschädigung der darunter liegende Gewebe zu entfernen und so kranialen Fenster Chirurgie kann schwierig, zeitaufwendig und Gewebeschäden zu produzieren. Piezoelektrischen Chirurgie, die umfassend für Gesichtschirurgie und zahnärztliche Chirurgie verwendet wird, nutzt Ultraschall-Schwingungen um Knochen zu entfernen, ohne weiche Gewebe zu beschädigen. Wir haben eine Methode anwenden von piezoelektrischen Chirurgie zur Verbesserung der kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen in der Vorbereitung für die multiphoton Bildgebung entwickelt. Vergleiche in unserem Labor feststellen, dass die Methode weniger Operationszeit erfordert und eine niedrigere durchschnittliche Rate von Komplikationen hat durch dural Blutungen als kranialen Fenster Chirurgie mit einem rotierenden Bohrer.

Entfernen Sie bevor Sie mit piezoelektrischen Chirurgie alle verbleibenden Knochenhaut vom Schädel. Sobald der Schädel undurchsichtig und glatt ist (Abbildung 1a), kann der Chirurg piezoelektrischen Chirurgie beginnen. Wenn Sie Knochen mit der vibrierenden Piezo-Spitze zu entfernen, ist es wichtig, den Schädel mit Eis zu bewässern kalt ACFS. Richtige Bewässerung ist erreicht, wenn die unten 1 mm von der Spitze in ACFS (Abbildung 1 b) untergetaucht ist. Ohne richtige Bewässerung wird der Knochen überhitzt und schädigen das Gehirn. Nachdem der Schädel auf die gewünschte Tiefe gewählt durch den Chirurgen ausgedünnt wurde, möglicherweise einige verbleibende Blutungen aus den Blutgefäßen befindet sich im Knochen. Um schnell alle Blutungen aufhören, ein kleiner 1 mm Stück Kollagen Schaum trieft ACFS zum Bereich des Fensters. Lassen Sie das Kollagen sitzen auf den Schädel für ca. 30 s (Abbildung 1 c). Nachdem der Kollagen-Schaum entfernt ist, erscheint das Fenster transparent, sodass klare Visualisierung der Blutgefäße in der Dura. Die Dura werden ohne erhebliche Blutergüsse intakt. (Abbildung 1-d). Erscheint die Dura rot und entzündet, ist es wahrscheinlich aufgrund von defekten Blutgefäße aus zu viel Druck auf die Spitze während der Operation. Zum Schutz des neuen Fensters und chronische Bildgebung vorbereiten, muss ein Glas Deckglas auf der Fläche platziert werden. Eine richtig angewandte Glas Deckglas wird sanft über dem Fenster sitzen und wird auf dem Gebiet keinen Schaden. Die Glas-Deckglas muß das gesamte Fenster abdecken. Wenn Glas Deckglas auf den Schädel richtig angewendet wird, bleibt das Fenster unter dem Glas lichtdurchlässig. Die Blutgefäße in der Dura werden weiterhin sichtbar (Abb. 1e). Zahnärztliche Acryl muss rund um die Glas-Deckglas, permanent an der Oberfläche des Schädels haften angewendet werden. Die Kanten der Glas-Deckglas darf auch in zahnärztliche Acryl (Abb. 1f) abgedeckt werden.
Wir fanden, dass piezoelektrische Chirurgie ist in der Regel viel schneller als eine traditionelle kranialen Fenster unter ca. 10-12 Minuten pro Operation (Abbildung 2A). Wir fanden auch, dass es weniger Komplikationen aufgrund von Dura Blutergüsse und Blutungen von Auge (Abbildung 2 b) beobachtet. Einem entsprechend vorbereiteten Fenster ermöglicht multiphoton Bildgebung von fluoreszierenden Indikatoren in kortikalen Neuronen in Vivo. Wir entschieden uns für das rote Kalzium Kennzeichen JRGECO1a in Zellkörpern der kortikalen Neuronen Layer 4 Bild (Abbildung 3A-3 b). Wir konnten beobachten, Kalzium Transienten in diese Zelle Körper durch das Fenster PHASOR zubereitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Abbildung 1: piezoelektrischen Chirurgie. (ein) des Schädels, nachdem es richtig für PHASOR vorbereitet wurde. Die periostalen Gewebe wurde entfernt, so dass eine glatte und saubere Oberfläche. (b) ein repräsentatives Bild der PHASOR im Gange. Unten 1 mm von der vibrierenden chirurgische Tipp im Eis versinkt kalt ACFS. Die Flüssigkeit wird auf den Schädel mit einer Rate von 1 mL/min angewendet. Eine leichte Kreisbewegung gilt für den Schädel und Knochen wird per Ultraschall-Schwingungen ausgedünnt. (c) Nachdem der Schädel ausgedünnt worden, ein 1 mm rundes Stück von Kollagen Schaum trieft Kälte ACFS erlaubt ist, auf das Fenster, Mikro blutet aus dem Knochen zu stoppen. (d) eine erfolgreiche Fenster mit einer transluzenten Dura zeigt alle die intakte Blutgefäße. Es gibt keine sichtbaren Schäden oder Blutergüsse an der Oberfläche des Gehirns. (e) ein Glas-Deckglas befindet sich über dem Fenster zum Schutz der Oberfläche des Gehirns. (f) zahnärztliche Acryl wird der Schädel um die Glas-Deckglas über das Fenster dauerhaft zu beheben. Skala 1 mm in allen Bildern.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Abbildung 2: Vergleich der Erfolgsquote bei der Ausbildung für PHASOR oder zahnärztliche Bohren Chirurgie. (A) durchschnittliche Zeit pro Operation war für PHASOR Zahnbohrer Operationen niedriger (p < 0,05, zwei tailed t-Test) n = 30 Operationen pro Gruppe und durchschnittlich 10 Operationen pro Operateur. (B) der Prozentsatz der erfolgreichen Operationen (definiert als keine Blutungen oder sichtbare Schäden an der Dura, wie der Chirurg durch die Zielsetzung, 350 X Zoom Auge beobachtet) lag für PHASOR über Zahnbohrer Operationen (n = 30 Operationen für jede Gruppe eine lierten Z-Test). Fehlerbalken zeigen SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Abbildung 3. Multiphoton Bildgebung in Vivo durch ein kranialen Fenster mit PHASOR verdünnt. (A) Kalzium, die Transienten beobachtet mit dem roten Kalzium Kennzeichen JRGECO1a in Schicht 4 pyramidale Neuronen in murinen motorischen Kortex in Vivoabgebildet waren. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) das gleiche Fenster aber anderen Region der Schicht 4 motorische Kortex. Headfixed-Maus mit 3 mm Fenster mit PHASOR vorbereitet. Maßstabsleiste = 30 µm. abgebildeten mit einem multiphoton Mikroskop 40 X Objektiv, 1040 nm Anregung Wellenlänge.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelektrischen Chirurgie führte zu Verbesserungen in der menschlichen Kiefer- und zahnärztliche Chirurgie. Wir haben ein Protokoll zur Optimierung der piezoelektrischen Chirurgie für kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen entwickelt.

Piezo-hohe Genauigkeit chirurgische Osteal Entfernung (PHASOR): Eine Technik für verbesserte kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

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JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K Aufrufe.  Columbia University Medical Campus. Piezoelektrischen Chirurgie führte zu Verbesserungen in der menschlichen Kiefer- und zahnärztliche Chirurgie. Wir haben ein Protokoll zur Optimierung der piezoelektrischen Chirurgie für kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen entwickelt.

Serie: Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can produce a rewarding effect that strengthens action-outcome associations and reinforces future behavior directed at obtaining these foods. Increasing evidence that the rewarding effects of energy-dense foods play a profound role in overeating and the development of obesity has heightened interest in studying the genes, molecules and neural circuitry that modulate food reward1,2. The rewarding impact of different stimuli can be studied by measuring the willingness to work to obtain them, such as in operant conditioning tasks3. Operant models of food reward measure acquired and voluntary behavioral responses that are directed at obtaining food. A commonly used measure of reward strength is an operant procedure known as the progressive ratio (PR) schedule of reinforcement.4,5 In the PR task, the subject is required to make an increasing number of operant responses for each successive reward. The pioneering study of Hodos (1961) demonstrated that the number of responses made to obtain the last reward, termed the breakpoint, serves as an index of reward strength4. While operant procedures that measure changes in response rate alone cannot separate changes in reward strength from alterations in performance capacity, the breakpoint derived from the PR schedule is a well-validated measure of the rewarding effects of food. The PR task has been used extensively to assess the rewarding impact of drugs of abuse and food in rats (e.g.,6-8), but to a lesser extent in mice9. The increased use of genetically engineered mice and diet-induced obese mouse models has heightened demands for behavioral measures of food reward in mice. In the present article we detail the materials and procedures used to train mice to respond (lever-press) for a high-fat and high-sugar food pellets on a PR schedule of reinforcement. We show that breakpoint response thresholds increase following acute food deprivation and decrease with peripheral administration of the anorectic hormone leptin and thereby validate the use of this food-operant paradigm in mice.

The present report details the protocol employed to measure the rewarding effects of high-fat food in mice using a progressive ratio operant conditioning task.

Progressive-Verhältnis reagiert Palatable für High-Fett-und High-Zucker Lebensmittel in Mäuse

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht<em&gt; In Vivo</em&gt; Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous deoxyhemoglobin as an endogenous contrast agent to detect changes in blood-level-dependent oxygenation (BOLD effect). We combined fMRI with a novel robotic device (MR-compatible hand-induced robotic device [MR_CHIROD]) so that a person in the scanner can execute a controlled motor task, hand-squeezing, which is a very important hand movement to study in neurological motor disease. We employed parallel imaging (generalized auto-calibrating partially parallel acquisitions [GRAPPA]), which allowed higher spatial resolution resulting in increased sensitivity to BOLD. The combination of fMRI with the hand-induced robotic device allowed precise control and monitoring of the task that was executed while a participant was in the scanner; this may prove to be of utility in rehabilitation of hand motor function in patients recovering from neurological deficits (e.g., stroke). Here we outline the protocol for using the current prototype of the MR_CHIROD during an fMRI scan.

We performed functional MRI using a novel MRI-compatible hand-induced robotic device to evaluate its utility for monitoring hand motor function in individuals recovering from neurological deficits.

Funktionelle MRT in Verbindung mit einem neuartigen MRT-kompatiblen handinduzierten Robotergerät zur Bewertung der Rehabilitation von Personen, die sich von Handgriff-Defiziten erholen

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) remain unclear. In order to adequately study the attributes of endolymphatic hydrops, such as the origins of low-frequency hearing loss, a reliable model is needed. The guinea pig is a&#160;good model because it hears in the low-frequency regions that are putatively affected by endolymphatic hydrops. Previous research has demonstrated that endolymphatic hydrops can be induced surgically via intradural or extradural approaches that involve drilling on the endolymphatic duct and sac. However, whether it was possible to create an endolymphatic hydrops model using an extradural approach that avoided dangerous drilling on the endolymphatic duct and sac was unknown. The objective of this study was to demonstrate a revised extradural approach to induce experimental endolymphatic hydrops at 30 days post-operatively by obliterating the endolymphatic sac and injuring the endolymphatic duct with a fine pick. The sample size consisted of seven guinea pigs. Functional measurements of hearing were made and temporal bones were subsequently harvested for histologic analysis. The approach had a success rate of 86% in achieving endolymphatic hydrops. The risk of cerebrospinal fluid leak was minimal. No perioperative deaths or injuries to the posterior semicircular canal occurred in the sample. The presented method demonstrates a safe and reliable way to induce endolymphatic hydrops at a relatively quick time point of 30 days. The clinical implications are that the presented method provides a reliable model to further explore the origins of low-frequency hearing loss that can be associated endolymphatic hydrops.

This article demonstrates an extradural approach to obliterate the guinea pig endolymphatic sac and injure the endolymphatic duct with a fine pick in order to induce experimental endolymphatic hydrops.

Ein überarbeiteter chirurgischer Ansatz zur Induzieren von endolymphatischen Hydrops im Meerschweinchen

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...