Name: piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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Tamara Zeric für die Hilfe, das multiphoton Bild in diesem Papier zu erhalten. Durch das Gehirn & Verhalten, Parkinson und JPB Stiftungen, R01 MH108186 und R01 DA07418 unterstützt. F31-Stipendium 1F31MH109293-01A1 S c.

Alle Verfahren, die mit Tieren nach den Standards durchgeführt wurden festgelegt durch die Columbia University Medical Center institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Euthanasie erfolgte durch zervikale Dislokation in Narkose mit Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg intraperitoneal injiziert. Alle chirurgischen Eingriffe wurden in einer sterilen Weise durchgeführt (Chirurg trug Kopf Kappe, Gesichtsmaske, sterile Handschuhe und sauber Einweg Kittel) und chirurgische Instrumente wurden zwischen jedem Gebrauch autoklaviert.
(1) präoperativen Schritte
<ol><li>Autoklav alle chirurgischen Instrumente, um Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>C57bl6 Mäuse mit Isofluran (4 % für die Induktion und 1,5-2 % für die Chirurgie) zu betäuben. Kneifen Sie die Hinterbeine Zehe alle 10 Minuten, um richtige Tiefe der Narkose zu gewährleisten. Anästhesie zu erhöhen, wenn Vokalisation oder hinteren Gliedmaßen einfahren gesehen wird.</li>
	<li>Wenden Sie tierärztliche Auge Schmiermittel für die Augen austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haare über der Kopfhaut mit einer Anwendung von 3 min Entfernung Haargel oder durch Rasur mit einem Elektrorasierer.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen oder eine kalibrierte Wasser rezirkulierenden Decke legen Sie auf 38° C.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zur präoperativen Analgesie zur Verfügung zu stellen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei wechselnden Anwendungen von Chlorhexidin oder Betadine und 70 % Ethanol mit einem Baumwolle Applikator gekippt.</li>
	<li>100 mL Bupivacain verdünnt 50 % Kochsalzlösung unter der Kopfhaut zu örtlicher Betäubung zu injizieren.</li>
</ol>(2) piezoelektrischen kranialen Fenster Chirurgie
<ol><li>Mit autoklaviert sterilen chirurgischen Instrumenten, entfernen Sie einen 1 cm Kreis der Kopfhaut über den Schädel durch Schneiden mit einer chirurgischen Schere in einem kreisförmigen Muster. Heben Sie die Kopfhaut aus der Schädel auszusetzen das Periost Gewebe über den Knochen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Spitze der Zange um die freiliegenden Knochen frei von jeder verbleibende Periost Gewebe reiben. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass der dental Zement nicht später fallen wird.</li>
	<li>Stellen Sie die piezoelektrischen Chirurgie-Einheit auf der niedrigsten Stufe zu vibrieren. Beachten Sie, dass höhere Einstellungen Blutgefäße durch intensive Vibrationen brechen können.</li>
	<li>Die sterile Runde Spitze auf das Handstück zu beheben. Hinweis: Die 4 mm Runde Spitze eignet sich gut für Operationen. Die große Spitzengröße trägt zur Geschwindigkeit der Operation wie das gesamte Fenster gleichzeitig verdünnt werden kann.</li>
	<li>Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit Eis kalt künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) und halten Sie ihn in die Hand, die nicht das piezoelektrische Handstück.</li>
	<li>Den Schädel von tropft der ACFS aus der Spritze auf den Schädel mit einer Rate von 1 mL/min. Alternativ zu bewässern, verwenden einer peristaltischen Pumpe positioniert über den Schädel, um die Verwendung der anderen Hand zu befreien. Hinweis: Bewässerung mit kalten ACFS ist wichtig, eine Überhitzung aufgrund der Reibung von der hochfrequente Schwingungen zu vermeiden.</li>
	<li>Tragen Sie sanft vibrierenden chirurgische Tipp an den Schädel mit leichten kreisenden Bewegungen (3 Kreise pro 1 s) und dünnen Knochen auf die gewünschte Tiefe eine dünne Schädel-Vorbereitung (5-10 min) durchführen. Hinweis: Hier wurden 4 mm Fenster gefertigt, die bis 20 µm ausgedünnt wurden. Allerdings variiert die Größe des Fensters mit der Größe der chirurgischen Spitze. Die Stärke des Knochens kann auf die gewünschte Tiefe basierend auf der Länge der Zeitaufwand bei der Anwendung der Tipp mit dem Schädel angepasst werden.</li>
	<li>Sanft einstellen Sie den Winkel des Handstücks und ändern Sie den Winkel der Spitze beim Druck auf den Schädel, den Schädel gleichmäßig dünn.</li>
	<li>Um eine komplette Knochenentfernung durchzuführen ohne jede dünne Knochen hinter, dünne Knochen bis Risse um die Fensterfläche sichtbar sind. Entfernen Sie die restlichen Flocken von dünnen Knochen ohne Beschädigung der zugrunde liegenden Dura mit Zange.</li>
	<li>Ein 1 mm Stück Schaumstoff blutstillende Kollagen in kalten ACFS einweichen. Halten Sie den nassen Schaum mit Zange und legen Sie es auf die dünne Schädel. Lassen Sie ihn sitzen auf dem dünnen Schädel für ca. 30 s, jede Mikro zu stoppen blutet aus den Entwicklungsländern.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange, ein 4 mm Glas Deckglas seitlich über dem Fenster platzieren, der in den Knochen ausgedünnt wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie die Rückseite ein kleiner aus Holz oder Plastik Baumwolle Applikator gekippt ca. 100 µL zahnärztliche Acryl auf den Schädel um das Fenster zu fixieren anwenden.</li>
</ol>3. post OP Pflege
<ol><li>Entfernen Sie die Maus aus dem chirurgischen Gerät und legen Sie sie in einem beheizten Käfig für die Wiederherstellung. Überwachen sie kontinuierlich, bis es volle Bewusstsein (durch normale Beweglichkeit, Gang und Verhalten bewertet) wiedererlangt hat.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Tiere zweimal täglich für drei Tage für Manifestationen der Schmerzen nach der Operation einschließlich verminderte Aktivität, Pflege, Ernährung und Wasserverbrauch, bewachen Verhalten (z. B. hinken oder ein Buckliger Haltung) oder erhöhte Aggression. Das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt hat.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin (0,05 – 0,1 mg/kg) subkutan als eine analgetische 8 – 12 h nach der Operation für 3 Tage. Überwachen Sie den Bereich des Fensters eng nach der Operation für Dehiszenz, Entzündungen und Anzeichen einer Infektion. Wenn das Tier nicht zu Baseline Fütterung und Pflege Verhaltensweisen zurück, konsultieren Sie einen Tierarzt bezüglich etwaiger Interventionen oder Euthanasie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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Gibt es keine Angaben.

Die Operation kann durch Ändern der chirurgischen Spitze geändert werden. Es gibt viele verschiedene Größen der Spitze, die das Handstück angewendet werden können. Ändern der Größe oder Form der Spitze wird in verschieden große Fenster führen. Neben den 4 mm-Tipp wir auch versucht eine 3 mm Spitze und fand es auch gut funktioniert. Auch bei Bewässerung mit Eis kalt ACFS konnten wir nicht bekommen gute Ergebnisse mit Tipps, die zu (ca. 0,25 mm) aufgrund der konzentrierten Vibrationen verursacht zu viel Hitze und Brennen des Knochens führt um zu Beschädigung der zugrunde liegenden Dura schmal waren. Wir haben nicht versucht, die Vielzahl der anderen Tipps, die verfügbar sind, und wir erwarten, dass andere Labore können neue Anwendungen für diese verschiedenen Tipps zu finden. Während die Operation relativ einfach ist, fanden wir, dass es gibt mehrere Schritte, die zur Fehlerbehebung benötigen. Die erste ist, dass die vibrierende Spitze viel Turbulenzen in der ACFS die Sichtbarkeit verringert und Schwierigkeiten produziert bei der Ermittlung von Knochen Tiefe während des Knochens dünner Schritt der Operation produziert. Wir empfehlen, wenn es zu schwierig, zu sehen, wie dünn der Knochen ist, machen eine Pause, die Schädel und Fenster trocknen durch die Anwendung einer sterilen Wattetupfer auf die Seite des Knochens. Die Wattestäbchen nicht direkt ans Fenster, anwendbar, da die rauhe Oberfläche dünne Knochen schadet. Nach der Überprüfung der tiefes erneut ACFS und fahren Sie mit der Operation. Wir fanden auch, dass wenn es beschädigt die Dura ist, ist es in der Regel aufgrund der Chirurg zu viel Druck auf die Spitze. Halten das Handstück schonender und weniger Kraftaufwand werden wahrscheinlich dieses Problem zu beheben. Wenn der Chirurg gewaltsam die Spitze auf den Knochen Schaben, wird dazu führen, dass eine Pause in den dünnen Knochen und beschädigen den Schädel. Schließlich erscheint nach Ausdünnung des Knochens, die zugrunde liegenden Dura verletzt, ist es wahrscheinlich durch überschüssige Wärme aus den Schwingungen. Erhöhung der ACFS fließen, um dieses Problem zu beheben.
Die wichtigste Einschränkung der PHASOR ist, dass das Handstück kann den Knochen dünn, aber nicht über die Dura alle Knochen entfernen. Die Diamant beschichteten Spitze hat kleine grobe Unebenheiten. Die Reibung benötigt, um den Schädel zu dünn würde die Dura abzuschleifen und Blutungen, wenn es verwendet wurden, um den Knochen zu entfernen. Somit ist der Einsatz von Zange erforderlich, um die verbleibenden dünnen Schicht zu entfernen. Während es fortwährende Debatte gibt auf ob Bildgebung durch eine dünne Schädel weniger Entzündungen und weniger Verbreitung von Mikroglia und reaktive Astrocyten produziert, in einigen Fällen ist ein Fenster mit keine Knochen verbleibenden bevorzugt, z. B. zu einer größeren Tiefe von imaging-3 .
Wir haben kranialen Fenster Vorbereitung multiphoton Bildgebung bei Mäusen optimiert. PHASOR ist unseres Wissens die erste Anwendung der Piezo-Technik, Nagetier kranialen Fenster Chirurgie für optische Bildgebung. Wir finden, dass die Nutzung der piezoelektrischen Chirurgie bei Mäusen die Vorteile der erhöhten Geschwindigkeit teilt und unerwünschte Ereignisse auch in Menschen7,8,9,10berichtet verringert. Auslastung der piezoelektrische Vorrichtung führte zu schnelleren Operationen (Abbildung 2A) und weniger Nebenwirkungen von Blutungen im Vergleich zu einem High-Speed Rotary bohren (Abb. 2 b). Wir fanden auch in unserem Labor, dass PHASOR einfacher für neue Chirurgen zu erlernen als traditionelle Ansätze zur kranialen Fenster Operation war. Vorteile von Geschwindigkeit und Benutzerfreundlichkeit werden voraussichtlich unter Chirurgen unterscheiden. Dünne Schädel Vorbereitungen erfordern in der Regel 30-45 min, dünne Knochen mit einem Bohrer und Skalpell2, während der PHASOR Ansatz in der Regel weniger als 10 Minuten erfordert.
Wir fanden, dass in Windows vorbereitet mit PHASOR Kalzium Transienten in Schicht 4 pyramidenförmigen Nervenzellen im motorischen Kortex vorstellen könnte, die mit Adeno-associated Virus Codierung des Kalzium-Indikators JRGECO1a transfiziert worden war (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). wir fanden auch, dass im Vergleich zu einem dünnen Schädel kranialen Fenster vorbereitet mit einem rotierenden Bohrer und Skalpell, die bildgebende Region war größer, während eine dünne Schädel mit einem rotierenden Bohrer vorbereitet und Skalpell hat ein imaging-Fenster von 20 µm Durchmesser2 . Mit PHASOR konnten wir schnell eine Fläche von ca. 3-4 mm dünn. Dies ist vergleichbar mit der bildgebenden Fenster mit PoRTS4berichtet. Diese größere Fenster behält den Vorteil der schnellen Bildgebung für dünne Schädel Windows vorbereitet mit einem Zahnbohrer und Skalpell gemeldet. Darüber hinaus kann das Fenster mit PHASOR zubereitet sofort abgebildet, im Gegensatz zu traditionellen Knochenentfernung abgebildet Windows, die Wochen zu heilen, bevor das Fenster optimal sein kann verlangen3.
Diese Technik kann angewendet werden, um Veränderungen des Blutflusses in den Gefäßen unter der Dura zu studieren. Eine wichtige zukünftige Studie soll Immunoreactivity PHASOR mit anderen Methoden der kranialen Fenster zu vergleichen. Dies wäre wichtig, um festzustellen, ob PHASOR weniger Entzündung im Vergleich zu bisherigen Methoden produziert. Wir hoffen, dass die piezoelektrische Operationstechnik, die hier dokumentiert wird mehr Labs kranialen Fenster und Multiphoton in Vivoimaging erfolgreich zu nutzen.
Stellen Sie sicher, dass das Handstück auf die niedrigste Einstellung vibrieren soll und dass der ACFS ist mit einer konstanten Rate bewässert wird. Die eiskalte ACFS ständig angewendet werden muss oder es wird erhitzen und beschädigen die Dura. Wir fanden, dass ACFS muss, mit einer Rate von mindestens 1 mL/min, verwenden Sie entweder eine Spritze in der Hand gehalten angewendet werden, oder verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, anstatt die integrierte Bewässerung im Handstück. Das Bewässerungssystem im Handstück wirft ACFS zu kräftig und produziert zu viel Turbulenzen, die Sicht erheblich beeinträchtigen wird.

Kranialen Fensters Chirurgie zur in-Vivo imaging Multiphoton Nagetiere Vorbereitung ist eine wichtige Technik in den Neurowissenschaften geworden. Die Entfernung oder Ausdünnung der Knochen ist muss man die Maus für die optische Bildgebung mit einem multiphoton Mikroskop vorbereiten. Diese Chirurgie wird durch eine Fläche von Knochen, die zugrunde liegenden Dura1aussetzen vollständig zu entfernen oder durch Ausdünnung einer Region des Knochens ohne vollständige Entfernung von Dura2durchgeführt. Der dünne Schädel-Ansatz kann zu weniger Entzündungen und Aktivierung der Mikroglia3 jedoch bietet eine flachere Schärfentiefe-imaging, imaging eine kleinere Fenstergröße (200 µm) und einen begrenzten Zeitraum, während dessen das Fenster wegen Knochen nachwachsen2 abgebildet werden können . Die Zugabe von einem polierten und verstärkte Glasfenster (PoRTS) kann die bildgebenden Größe und bildgebenden Zeitraum verbessern aber ist schwierig,4durchführen.
High-Speed rotierende Bohrer verwenden beide aktuellen Operationen zu dünn oder entfernen die Knochen aus dem Schädel. Die dünne Schädel-Technik nutzt auch ein Skalpell nach den Bohrer weiter Ausdünnen der Knochen-2. Die PoRTS-Technik erfordert den zusätzlichen Schritt der high-Speed-Polieren mit Körnung4. In einer hohen Geschwindigkeit verursacht rotierende Bohrer, angetriebene Luftturbine oder Elektromotor die Bohrkrone mit hoher Geschwindigkeit drehen. Wie rotierende Bohrer Knochen und Weichgewebe Abschnitt, gibt es ein Risiko der Beschädigung der Dura und zugrunde liegenden Blutgefäße. Der Erfolg der Operation hängt von der Geschicklichkeit des Operateurs. Zusätzlich zu diesen Fenstern mit mechanischen chirurgischen Methoden vorbereitet wurde eine chemische Methode optisch den Schädel mit unterschiedlichen Lösungen entwickelten5,6. Da piezoelektrischen Chirurgie eine mechanische Methode der Operation ist, werden unsere Vergleiche hier jedoch auf andere mechanische Methoden beschränkt werden.
Piezoelektrische chirurgische Geräte nutzen Ultraschallschwingungen zum Abbau von mineralisierten Knochen ohne schädliche zugrunde liegende Weichgewebe und bieten somit einen Ansatz um schnell eine große Fläche des Knochens dünn. In einem piezoelektrischen chirurgischen Handstück die Turbine wird durch einen Stapel von Keramikscheiben ersetzt und wenn Strom angewendet wird, die Scheiben vibrieren bei Ultraschall-Frequenzen. Die Schwingungen werden durch das Handstück zu Diamant beschichtete Spitzen Knochen ohne schädliche Weichteile, einen Vorteil gegenüber rotierenden Bohrer durchschneiden, die nicht zwischen Gewebetypen diskriminieren übertragen. Piezoelektrischen Chirurgie wurde ursprünglich für den Einsatz in der Human-von Tomaso Vercellotti entwickelt und führte zu Verbesserungen in Dental und Cranio-Maxilofacial Chirurgie7,8,9,10,11 .
Piezoelektrischen Chirurgie verwendet wurde, um eine Osteotomie in Wistar Ratten zu schaffen und fand durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) und Histologie, deutlich weniger Schaden als eine traditionelle Zahnbohrer12zu produzieren. Die Autoren folgerten, dass piezoelektrische Chirurgie sicher zum Entfernen des Knochens in der Nähe von weichen Hirngewebe. Mäuse, haben jedoch ein dünner Dura, die leicht beschädigt ist, und diese Studie chronische optische Bildgebung nicht Windows vorbereiten. Chronische Bildgebung erfordert, dass die Blutgefäße nicht beschädigt werden und unter dem Fenster keine Blutgerinnsel bilden. Schädigung der Dura führt zu Entzündungen, die bewirkt, das Fenster dass in die cloud, und aktiviert Mikroglia und die Verbreitung von reaktiven Astrozyten. Hier haben wir piezoelektrischen Chirurgie für Mäuse dünne Schädel und voller Knochen entfernen kranialen Fenster geeignet für chronische Belichtung erstellen optimiert. Wir verglichen diese Operationstechnik zu kranialen Fenster Operationen mit hoher Geschwindigkeit rotierende Bohrer vorbereitet.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP model has the same settings</td></tr><tr><td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td></tr><tr><td>Stereotax frame</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump for irrigation.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Much stronger than regular dental acrylic.</td></tr><tr><td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube opthalmic ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN Vector Core</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

Multiphoton Mikroskopie ist weithin für Neuronen in Vivoimaging angepasst worden. Wiederholte Bildgebung erfordert Implantation eines kranialen Fensters oder wiederholte Verdünnung des Schädels. Kranialen Fensters Operation erfolgt in der Regel mit einem hohen Geschwindigkeit rotierende Bohrer, und viele Forscher finden es schwierig um zu verhindern, dass den Bohrer Beschädigung der empfindlichen Dura und Blutgefäße. Umfangreiche Ausbildung und Praxis ist erforderlich, um den Knochen ohne Beschädigung der darunter liegende Gewebe zu entfernen und so kranialen Fenster Chirurgie kann schwierig, zeitaufwendig und Gewebeschäden zu produzieren. Piezoelektrischen Chirurgie, die umfassend für Gesichtschirurgie und zahnärztliche Chirurgie verwendet wird, nutzt Ultraschall-Schwingungen um Knochen zu entfernen, ohne weiche Gewebe zu beschädigen. Wir haben eine Methode anwenden von piezoelektrischen Chirurgie zur Verbesserung der kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen in der Vorbereitung für die multiphoton Bildgebung entwickelt. Vergleiche in unserem Labor feststellen, dass die Methode weniger Operationszeit erfordert und eine niedrigere durchschnittliche Rate von Komplikationen hat durch dural Blutungen als kranialen Fenster Chirurgie mit einem rotierenden Bohrer.

Entfernen Sie bevor Sie mit piezoelektrischen Chirurgie alle verbleibenden Knochenhaut vom Schädel. Sobald der Schädel undurchsichtig und glatt ist (Abbildung 1a), kann der Chirurg piezoelektrischen Chirurgie beginnen. Wenn Sie Knochen mit der vibrierenden Piezo-Spitze zu entfernen, ist es wichtig, den Schädel mit Eis zu bewässern kalt ACFS. Richtige Bewässerung ist erreicht, wenn die unten 1 mm von der Spitze in ACFS (Abbildung 1 b) untergetaucht ist. Ohne richtige Bewässerung wird der Knochen überhitzt und schädigen das Gehirn. Nachdem der Schädel auf die gewünschte Tiefe gewählt durch den Chirurgen ausgedünnt wurde, möglicherweise einige verbleibende Blutungen aus den Blutgefäßen befindet sich im Knochen. Um schnell alle Blutungen aufhören, ein kleiner 1 mm Stück Kollagen Schaum trieft ACFS zum Bereich des Fensters. Lassen Sie das Kollagen sitzen auf den Schädel für ca. 30 s (Abbildung 1 c). Nachdem der Kollagen-Schaum entfernt ist, erscheint das Fenster transparent, sodass klare Visualisierung der Blutgefäße in der Dura. Die Dura werden ohne erhebliche Blutergüsse intakt. (Abbildung 1-d). Erscheint die Dura rot und entzündet, ist es wahrscheinlich aufgrund von defekten Blutgefäße aus zu viel Druck auf die Spitze während der Operation. Zum Schutz des neuen Fensters und chronische Bildgebung vorbereiten, muss ein Glas Deckglas auf der Fläche platziert werden. Eine richtig angewandte Glas Deckglas wird sanft über dem Fenster sitzen und wird auf dem Gebiet keinen Schaden. Die Glas-Deckglas muß das gesamte Fenster abdecken. Wenn Glas Deckglas auf den Schädel richtig angewendet wird, bleibt das Fenster unter dem Glas lichtdurchlässig. Die Blutgefäße in der Dura werden weiterhin sichtbar (Abb. 1e). Zahnärztliche Acryl muss rund um die Glas-Deckglas, permanent an der Oberfläche des Schädels haften angewendet werden. Die Kanten der Glas-Deckglas darf auch in zahnärztliche Acryl (Abb. 1f) abgedeckt werden.
Wir fanden, dass piezoelektrische Chirurgie ist in der Regel viel schneller als eine traditionelle kranialen Fenster unter ca. 10-12 Minuten pro Operation (Abbildung 2A). Wir fanden auch, dass es weniger Komplikationen aufgrund von Dura Blutergüsse und Blutungen von Auge (Abbildung 2 b) beobachtet. Einem entsprechend vorbereiteten Fenster ermöglicht multiphoton Bildgebung von fluoreszierenden Indikatoren in kortikalen Neuronen in Vivo. Wir entschieden uns für das rote Kalzium Kennzeichen JRGECO1a in Zellkörpern der kortikalen Neuronen Layer 4 Bild (Abbildung 3A-3 b). Wir konnten beobachten, Kalzium Transienten in diese Zelle Körper durch das Fenster PHASOR zubereitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Abbildung 1: piezoelektrischen Chirurgie. (ein) des Schädels, nachdem es richtig für PHASOR vorbereitet wurde. Die periostalen Gewebe wurde entfernt, so dass eine glatte und saubere Oberfläche. (b) ein repräsentatives Bild der PHASOR im Gange. Unten 1 mm von der vibrierenden chirurgische Tipp im Eis versinkt kalt ACFS. Die Flüssigkeit wird auf den Schädel mit einer Rate von 1 mL/min angewendet. Eine leichte Kreisbewegung gilt für den Schädel und Knochen wird per Ultraschall-Schwingungen ausgedünnt. (c) Nachdem der Schädel ausgedünnt worden, ein 1 mm rundes Stück von Kollagen Schaum trieft Kälte ACFS erlaubt ist, auf das Fenster, Mikro blutet aus dem Knochen zu stoppen. (d) eine erfolgreiche Fenster mit einer transluzenten Dura zeigt alle die intakte Blutgefäße. Es gibt keine sichtbaren Schäden oder Blutergüsse an der Oberfläche des Gehirns. (e) ein Glas-Deckglas befindet sich über dem Fenster zum Schutz der Oberfläche des Gehirns. (f) zahnärztliche Acryl wird der Schädel um die Glas-Deckglas über das Fenster dauerhaft zu beheben. Skala 1 mm in allen Bildern.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Abbildung 2: Vergleich der Erfolgsquote bei der Ausbildung für PHASOR oder zahnärztliche Bohren Chirurgie. (A) durchschnittliche Zeit pro Operation war für PHASOR Zahnbohrer Operationen niedriger (p < 0,05, zwei tailed t-Test) n = 30 Operationen pro Gruppe und durchschnittlich 10 Operationen pro Operateur. (B) der Prozentsatz der erfolgreichen Operationen (definiert als keine Blutungen oder sichtbare Schäden an der Dura, wie der Chirurg durch die Zielsetzung, 350 X Zoom Auge beobachtet) lag für PHASOR über Zahnbohrer Operationen (n = 30 Operationen für jede Gruppe eine lierten Z-Test). Fehlerbalken zeigen SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Abbildung 3. Multiphoton Bildgebung in Vivo durch ein kranialen Fenster mit PHASOR verdünnt. (A) Kalzium, die Transienten beobachtet mit dem roten Kalzium Kennzeichen JRGECO1a in Schicht 4 pyramidale Neuronen in murinen motorischen Kortex in Vivoabgebildet waren. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) das gleiche Fenster aber anderen Region der Schicht 4 motorische Kortex. Headfixed-Maus mit 3 mm Fenster mit PHASOR vorbereitet. Maßstabsleiste = 30 µm. abgebildeten mit einem multiphoton Mikroskop 40 X Objektiv, 1040 nm Anregung Wellenlänge.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelektrischen Chirurgie führte zu Verbesserungen in der menschlichen Kiefer- und zahnärztliche Chirurgie. Wir haben ein Protokoll zur Optimierung der piezoelektrischen Chirurgie für kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen entwickelt.

Piezo-hohe Genauigkeit chirurgische Osteal Entfernung (PHASOR): Eine Technik für verbesserte kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K Aufrufe.  Columbia University Medical Campus. Piezoelektrischen Chirurgie führte zu Verbesserungen in der menschlichen Kiefer- und zahnärztliche Chirurgie. Wir haben ein Protokoll zur Optimierung der piezoelektrischen Chirurgie für kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen entwickelt.

Serie: Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Entwicklungsbiologie

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medizin

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Abschätzung der thermischen Schädigung durch robotergebohrte Kraniotomie bei der kranialen Fensterchirurgie bei Mäusen

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

Integriertes Protokoll für FUN und Faserphotometrie bei frei beweglichen Mäusen

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is compatible with most of the existing modalities for monitoring brain functions in vivo. Integration with brain function recording modalities not only enables us to address orders and disorders of specific brain functions with closed-loop feedback but also provides us with mechanistic insights about FUN itself. Here, we provide a modified, simple, dependable, and robust protocol for the simultaneous application of FUN and fiber photometry GCaMP6s fluorescence recording in free-moving mice. This involves the fabrication of a well-sized single transducer and its temporary placement on the mice, along with the secure fixation of a fiber optical implant to facilitate the smooth passage of the transducer. The combination of FUN and fiber photometry provides for the optical recording of neural circuitry responses upon FUN in real-time in deep brain regions. To demonstrate the efficiency of this protocol, Thy1-GCaMP6s mice were used as an example to record the neuroactivity in the anterior thalamic nucleus during FUN while the mice are freely moving. We believe that this protocol can promote the widespread use of FUN in both the neuroscience field and the biomedical ultrasound field.

Autor im Rampenlicht: Integration von Faserphotometrie und fokussierter Ultraschall-Neuromodulation zur Untersuchung der neuronalen Modulation bei frei beweglichen

The protocol includes transducer manufacturing, parameters reporting, surgical procedure, and signal recording for the entire operational workflow of concurrent focused ultrasound neuromodulation and fiber photometry recording in free-moving mice.

Gleichzeitige fokussierte Ultraschall-Neuromodulation und Faserphotometrie-Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

Piezo-hohe Genauigkeit chirurgische Osteal Entfernung (PHASOR): Eine Technik für verbesserte kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen

Zusammenfassung

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Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Abschätzung der thermischen Schädigung durch robotergebohrte Kraniotomie bei der kranialen Fensterchirurgie bei Mäusen

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution

Gleichzeitige fokussierte Ultraschall-Neuromodulation und Faserphotometrie-Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen

Gleichzeitige fokussierte Ultraschall-Neuromodulation und Faserphotometrie-Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen