CRISPR-basierte Genom-Editierungswerkzeuge haben die Herstellung von gentechnisch veränderten Rep-Modellen erheblich erleichtert. Das CRISPR-System besteht aus einem einzelnen Guide-RNA-Komplex zu einer Cas9-Nuklease und kann so programmiert werden, dass es auf eine Sequenz von Interesse innerhalb des Genoms abzielt, um einen doppelsträngigen DNA-Bruch zu erzeugen. Durch die gleichzeitige Bereitstellung einer DNA-Reparaturvorlage kann dieser DNA-Bruch zusammen mit der Hinzufügung einer beliebigen DNA-Sequenz durch einen Prozess namens Homology Directed Repair präzise wiederhergestellt werden.
Durch diesen Prozess sind wir in der Lage, Knock-in-Rattenmodelle mit gezielten DNA-Insertionen oder -Substitutionen zu generieren. Unter Verwendung dieses Protokolls präsentieren wir einen modifizierten Ansatz, bei dem Adeno-assoziierte Viren verwendet werden, um Rattenembryonen eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, zusammen mit einer anschließenden Verabreichung von CRISPR-Cas9-Komplexen durch Elektroporation von Zweizellembryonen. Die AAV-Serotypen 1 oder 6 sind mit einer künstlich hergestellten DNA-Reparaturvorlage verpackt, die so konzipiert ist, dass sie durch den CRISPR-vermittelten Homology Directed Repair-Prozess in das Rattengenom integriert werden kann.
Das AAV wird zu einem 30-Mikroliter-Tropfen KSOM-Medium der Ratte in einer Endkonzentration von 3 x 10 bis zur 7. Genomkopie pro Mikroliter gegeben. Als nächstes werden frisch entnommene Embryonen im Einzellstadium mit sichtbaren Vorkernen auf AAV-haltige Medien übertragen, so dass die virale Transduktion stattfinden kann. Mit unserem Protokoll ist es nicht erforderlich, die Zona pellucida zu verdünnen, da die AAV-Serotypen 1 und 6 in der Lage sind, die Zona pellucida leicht zu passieren und eine effiziente DNA-Reparaturschablonenabgabe zu ermöglichen.
Die Embryonen werden mit dem AAV über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und maximaler Luftfeuchtigkeit kultiviert. Am nächsten Tag wird eine Elektroporationsmischung hergestellt, die hundert Nanogramm pro Mikroliter einzelner Leit-RNA und hundert Nanogramm pro Mikroliter Cas9-Protein enthält, das in OptiMIM-Medien verdünnt ist. Das Gemisch wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von CRISPR-RNP-Komplexen zu ermöglichen.
Während der Inkubationszeit wird der Elektroporator eingeschaltet und die Elektroden an den Glasschieberelektroden befestigt. Nachdem die RNP-Bildung abgeschlossen ist, werden fünf Mikroliter Elektroporationsgemisch zwischen die Elektroden pipettiert, wobei darauf geachtet wird, dass keine Luftblasen in die Lösung gelangen. Die Embryonen, die sich nun im Zweizellstadium befinden, werden aus dem AAV-haltigen Medium entnommen und vorsichtig in das Elektroporationsgemisch zwischen den Elektroden gebracht.
Die Embryonen werden ausgerichtet, so dass keine der beiden Elektroden berührt wird, da dies während der Elektroporation zu einer Lyse führt. Hier ist ein Blick auf dieses Verfahren durch das Mikroskop. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Impedanz abnimmt, wenn das Volumen zwischen den Elektroden zunimmt.
Aus diesem Grund und um die Elektroporationsmischung nicht zu verdünnen, sollten nur minimale Medien zusammen mit den Embryonen übertragen werden. Als nächstes wird die Impedanz gemessen, indem der Knopf mit dem Ohm-Symbol darauf gedrückt wird. Die Impedanz sollte im Bereich von 0,18 bis 0,3 Ohm liegen.
Befindet man sich in Reichweite, wird die Elektroporation durch Drücken des Startknopfes gestartet. Dieser Vorgang dauert nur ein paar Sekunden, und so sieht er durch das Mikroskop aus. Sie werden feststellen, dass sich auf jeder Elektrode schnell Blasen bilden.
Unmittelbar nach der Elektroporation werden die Embryonen aus dem Objektträger entnommen und dreimal in frischem Ratten-KSOM-Medium gewaschen. Die Embryonen können dann für In-vitro-Studien kultiviert oder auf Leihmütterchen übertragen werden, um lebende Nachkommen zu erzeugen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Schwellung des Embryos nach der Elektroporation häufig ist.
Diese Schwellung sollte nach einigen Stunden auf Kultur abklingen. Es ist auch üblich, zelluläre Fusionsereignisse bei bis zu 20 % der zweizelligen Embryonen nach der Elektroporation zu beobachten. Eine zelluläre Fusion kann in der Regel durch eine sorgfältige horizontale Ausrichtung der Embryonen zwischen den Elektroden vermieden werden.
Wir testen unser Protokoll an Rattenembryonen und screenen kultivierte Blasten auf die Insertion einer künstlich hergestellten kurzen künstlichen Intron-Sequenz, die zwei loxP-Stellen enthält. Wir stellten fest, dass über 60 % der Blastozysten das korrekt anvisierte Knock-in-Allel enthalten, basierend auf der Sequenzanalyse der nächsten Generation. Als nächstes testen wir unser Protokoll zur Herstellung lebender Knock-in-Ratten weiter und entwerfen ein Projekt zur Entwicklung einer Cre-Rekombinase-Beschichtungssequenz, die auf die ATG-Startstelle des DRD2-Gens der Ratte abzielt.
Von den 11 geborenen Nachkommen waren 10 positiv durch PCR-Analyse in den fünf primären Homologiearmen, drei primären Homologiearmen und einem internen PCR-Assay zum Nachweis der Cre-Rekombinase. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in sieben verschiedenen Projekten eine durchschnittliche Knock-in-Erfolgsrate von 76 % bei Gründertieren erreicht haben, die durch PCR-Analyse über Homologie-Armverbindungen und DNA-Sequenzverifizierung bestimmt wurde. Mit dieser AAV-vermittelten DNA-Verabreichung und der Elektroporationspipeline von Zweizellembryonen haben wir signifikant höhere Knock-in-Wirkungsgrade als herkömmliche Ansätze für DNA-Insertionen mit einer Länge von bis zu drei KB erzielt.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass wir die Anwendung dieses Verfahrens zwar in Rattenembryonen demonstriert haben, es aber auch auf andere Spezies angewendet werden kann, um gezielte DNA-Insertionen zu erzeugen.
