Höhlentiere bieten ein überzeugendes System zur Untersuchung verschiedener morphologischer, entwicklungs- und verhaltensauffälliger Merkmale. Aber einer der begrenzenden Faktoren bei der Etablierung dieses Modellsystems ist der Mangel an genetischen Werkzeugen, die es uns ermöglichen würden, die Genfunktion zu manipulieren. Hier zeigen wir drei verschiedene Ansätze zur Manipulation der Genfunktion im mexikanischen Höhlenfisch Astyanax mexicanus.
Diese Werkzeuge werden die Untersuchung der Gene ermöglichen, die natürlichen Variationen zwischen Oberflächenfischen und Höhlenfischen zugrunde liegen, und wie sie sich auf Phänotypen beziehen. Bethany Stahl, eine talentierte Postdoc in meinem Labor wird dieses Verfahren demonstrieren. Vor Beginn des Verfahrens eine 100 Milliliter Petrischale mit warmen 3%Agarose in Fischsystemwasser gelöst füllen und sorgfältig eine Eispritzform in die Agarose in einem 45-Grad-Winkel legen, bevor sie langsam die Form in die Agarose senken, um zu vermeiden, dass Luft unter der Form gefangen wird.
Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig die Form und lagern Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius für bis zu einer Woche. Ziehen Sie dann Nadeln aus Borosilikatglaskapillaren und einem Elektrodennadelzieher nach den Richtlinien des Herstellers. Verwenden Sie am Tag der Injektion eine Glaspipette, um einzellige Eier in die Injektionsplatte zu geben und bis zu fünf Reihen der Injektionsplatte mit 30 bis 40 Eiern pro Reihe zu füllen.
Halten Sie die Eier hydratisiert mit einer kleinen Menge Fischsystem Wasser. Morpholino auf Eis auftauen und die Injektionslösung so vorbereiten, dass 400 Piktogrammmorpholino pro Ei mit einer langen Microloader-Pipettespitze injiziert oder am Ende einen zwei bis vier Mikroliter Bolus hinzugefügt wird. Wenn alle Nadeln geladen sind, verwenden Sie Zangen, um die überschüssige Länge von den Injektionsnadelspitzen zu trimmen und die erste Nadel in einen Mikromanipulator zu montieren, der mit einem Picoliter-Mikroinjektor verbunden ist.
Legen Sie dann die Injektionsschale unter ein Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie den Mikromanipulator, um jedes Ei mit der Nadel zu durchdringen, bevor Sie einen Nanoliter Morpholino-Injektionslösung direkt in das Eigelb injizieren. Mischen Sie für die CRISPR-Injektion 25 Piktogramme Guide-RNA mit 300 Piktogrammen CRISPR-assoziierter Protein-9-Boten-RNA und injizieren Sie zwei Nanoliter der resultierenden RNA-Lösung in jeden Embryo, wie gezeigt. Für Tol2-Transposase und Tol2-flankierte Plasmid-Injektion, kombinieren Sie 25 Nanogramm pro Mikroliter Tol2 Boten-RNA mit 25 Nanogramm pro Mikroliter Tol2-Plasmid-Konstrukt und Phenolrot in RNase-freiem Wasser.
Dann injizieren Sie einen Nanoliter Lösung in jeden Embryo, wie gerade gezeigt. Um die Morpholino-injizierten Tiere an vier Tagen nach der Injektion zu untersuchen, je nach dem Gen von Interesse, visualisieren Sie die Fischlarven unter einem Stereomikroskop, um den Phänotyp der injizierten Tiere oder Videoaufzeichnungen zu beobachten, um das Verhalten zu messen. Um CRISPR-Indels zu prüfen, übertragen Sie CRISPR-injizierte Embryonen in PCR-Röhren und extrahieren Sie die DNA gemäß den Standard-DNA-Extraktionsprotokollen für Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-Analyse.
Um die Mutagenese zu bewerten, führen Sie fünf Mikroliter des PCR-Produkts drei Stunden lang auf einem 3%agarose Gel bei 70 Volt aus. Wilde, nicht-mutagenisierte DNA führt zu einem eindeutigen Band, während mutierte DNA zu einem schmierigen Band führt. Höhle Ein Mexicanus, der mit einer Kontrolle injiziert wird, weist eine deutlich mehr bewegungsmotorische Aktivität auf und reduziert den Schlaf über einen Zeitraum von 24 Stunden im Vergleich zu Oberflächenfischen, die mit einem Rührmorpholino injiziert werden.
Die Injektion des Hypocretin-Orexins Morpholino hat im Vergleich zu kontrolliert injizierten Fischen wenig Einfluss auf den Schlaf in Oberflächenfischen. Im Gegensatz dazu, Hypocretin Orexin Knockdown über Morpholino Injektion hat eine signifikante Wirkung auf den Schlaf in Höhlen-Wohnung Fisch, bietet einen direkten Zusammenhang zwischen Hypocretin Orexin Ausdruck und Schlafverlust. CRPSR-vermittelte Mutagenese des Albinismus-Gens OCA2 in Oberflächenfischen führt zu einigen Individuen homozygot für den Wildtyp OCA2-Positivallel und ist mit der Pigmentierung verbunden, während Personen, die zwei Kopien des CRISPR-mutierten OCA2-Negativalleels haben, Albino sind, was eine direkte Verbindung zwischen dem mutierten OCA2-Gen und dem Albinismus in der Fischhöhle bietet.
Wählen Sie F0 s positiv für die Tol2 übertragentransgene zurück zum Wild-Typ, um stabile F1-Linien zu generieren. Dies ermöglicht lebende Kalzium-Bildgebung zur Aufdeckung von Unterschieden in der neuronalen Aktivität, die Vermittlung von Verhaltensänderungen in der Höhlenumgebung und die Schaffung der Grundlage für die Expression vieler zusätzlicher Transgene zur Charakterisierung und Manipulation der Genfunktion in A mexicanus. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, die Eier fest auf den Teller zu laden, die Nadel richtig zu trimmen und die Mikroinjektion zu optimieren.
Nach einem erfolgreichen genetischen Knockdown, Transgenintegration oder CRISPR-vermittelter Genbearbeitung können diese Fische für Entwicklungs-, Verhaltens- und Hirnaktivitätsanalysen verwendet werden.
