Die Autoren schätzen die Beiträge Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, und die Mitglieder des Enquist Labor in die Feinabstimmung dieses Protokoll.

1. Erster Tag: Virusinfektion und Herstellung der Puffer <ol><li> Bereiten 5-10 Gerichte (15 cm Durchmesser) Gewebekulturzellen für eine Infektion, simplex zB PK-15-Zellen für Pseudorabiesvirus (PRV) oder Vero-Zellen für Herpes-Virus (HSV). </li><li> Wenn die Zellen 95 sind - 100% konfluent, infizieren sie zu einem (MOI) von 5-10. Um dies zu tun, impfen jede Platte mit Viren Lager in einem Gesamtvolumen von 4 ml pro Platte, dann inkubieren die Platten für 1 Stunde bei 37 ° C. Rock-Platten sanft alle 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zellmonolayer vollständig beschichtet mit dem Virus Inokulum bleibt. In der Zwischenzeit, warm das Medium für den nächsten Schritt. </li><li> Nach einer Stunde der Infektion, absaugen viralen Inokulum von den Platten, 15 ml warmes Medium und Inkubation bei 37 ° C für 12-20 Stunden in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Bereiten LCM-Puffer (siehe Tabelle 1) und Rock-Nacht bei 4 ° C für eine gute Durchmischung. Bereiten TNE zur Resuspension der viralen DNA (siehe Tabelle 2). </li></ol> 2. Zweiter Tag, Phase 1: Cell Lysis und Ultrazentrifugation <ol><li> Visuell, dass die Infektion der Zellen hat einheitliche zytopathischen Effekts (CPE) verursacht. Lassen Infektion, um die Fortschritte, bis alle Zellen aufgerundet haben, aber noch nicht von der Platte gehoben. </li><li> Kratzen Sie die infizierten Zellen in das Medium, und kombinieren Zellen und Medium in 50 ml konische Röhrchen. Die Zahl der konischen Rohren für diesen Schritt benötigt wird von der Anzahl der Gerichte für eine Infektion in Schritt 1.2 oben abhängen, kann z. B. ein 50 ml konischen Rohr zu Pellets verwendet werden maximal 3 Gerichte von 15 ml Medium je Optional:. Spülen Platten mit 10 ml PBS und mit den Zellen und Medium zu verbinden. </li><li> Centrifuge Zellen und Medium für 10 Minuten bei 2000 relativ centifugal (RZB) bei Raumtemperatur, dann absaugen Überstand und resuspendieren jedes Pellet in 10 ml PBS. Wenn die Pellets aus einer Virusinfektion in mehrere konische Röhrchen in Schritt 2.2 verteilt wurde, können diese in einem konischen Rohr bei diesem Schritt wieder zusammengeführt werden. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration. Optional: Das Pellet kann bei -20 ° C gelagert werden und das Protokoll weiter zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 3. Zweiter Tag, Phase 2: Ultrazentrifugation Halten Sie das Zellpellet und LCM-Puffer auf Eis, wenn möglich während der folgenden Schritte. <ol><li> Add β-Mercaptoethanol auf 0% Glycerin - LCM-Puffer. Begin Kühlung der Ultrazentrifuge (für Schritt 3,9 unten), indem Sie sie auf 4 ° C und das Einschalten des Vakuums. </li><li> Zellpellet in 5 ml von 0% Glycerin - LCM-Puffer, bis es nicht mehr klumpig. Wenn nötig, Wirbel das Rohr zu brechen alle ungelösten Zellpellet. </li><li> Auszug durch Zugabe von 1,5 ml Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) und Vortex kräftig. Sofort für 10 min bei 2000 rcf zentrifugiert bei einer Temperatur von 4 ° C. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze (Vermeidung der Schnittstelle) und Transfer in ein neues Röhrchen Optional:. Wenn das Pellet einer gallertartigen solide, können Sie schnell gießen Sie die obere Schicht in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Freon-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Sammeln Sie die obere Schicht (~ 5 ml) und an einem neuen Polyallomer Ultrazentrifuge Röhre. Add β-Mercaptoethanol auf die beiden verbleibenden Glycerin - LCM-Puffer. </li><li> Bereiten Sie einen Gradienten in der Polyallomer Zentrifugenröhrchen durch Unterlegen der Freon-Extrakt (oberste Schicht) mit 3 ml 5% Glycerin - LCM (Mittelschicht) und dann wieder Unterlegen mit 2,5 ml 45% Glycerin - LCM (untere Schicht). Verwenden Sie einen dünnen Pipette zum Überlaufen des Rohres Inhalte zu verhindern. </li><li> Falls erforderlich, bereiten eine entsprechende Balance Rohr mit den gleichen Anteilen von LCM-Puffer. </li><li> Transfer-Rohre in Ultrazentrifuge Eimer. Balance-Eimern bis zu 0,1 g voneinander, durch vorsichtiges Hinzufügen zusätzlicher 0% Glycerin - LCM-Puffer, um die oberste Schicht (~ 50-100 ul zu einem Zeitpunkt). </li><li> Mit einem kalten Ultrazentrifuge mit einer horizontalen oder Ausschwingrotor, drehen Sie das ausgewogene Proben für 1 Stunde bei 77.000 rcf (z. B. 25.000 UpM für eine SW41Ti Rotor) bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Während Ultrazentrifugation, um ein Glas Haken schwimmenden DNA bei der Ethanol-Fällung (4,6 unten) zu erfassen. Halten Sie beide Enden ein Glas Pasteur-Pipette sowie die Aussetzung der mittlere Abschnitt über einer Flamme. Wenn ein Abschnitt des Glases fast geschmolzen ist, ziehen Sie vorsichtig auf das Glas strecken, biegen Sie es vorsichtig, um eine eng abgewinkelten Haken (&lt;90 Grad) zu erstellen, und ziehen Sie kräftig zu versiegeln Ende. Wenn die Spitze des Glases Haken offen ist, halten Sie die Spitze über der Flamme, so dass das Glas schmilzt genug, um es zu schließen. </li><li> Nach der Ultrazentrifugation, sollten Sie eine dünne opake Pellet mit einem dunklen Fleck in der Mitte zu sehen. Vorsichtig absaugen der Flüssigkeit aus dem Rohr, einschließlich Schmalz an den Seiten, aber unter Vermeidung der Pellet am Boden des Röhrchens. </li><li> 0,5 ml TNE bei Raumtemperatur. </li><li> Lassen Sie das Pellet für mindestens 10 Minuten lang Hydratation des Pellets zu ermöglichen. Optional: Das Pellet kann auch in TNE Nacht resuspendieren, wenn bei 4 ° C gehalten </li></ol> 4. Dritter Tag: &quot;Ghost&quot; DNA Niederschlag <ol><li> Break up das Pellet durch Pipettieren mit einer kleinkalibrigen Pipettenspitze (zB p200 Pipettenspitze). Mach dir keine Sorgen Scheren bei diesem Schritt, da die virale DNA ist noch in Kapside an dieser Stelle enthalten. Fügen Sie die folgenden Reagenzien auf das Röhrchen mit dem viralen Pellet bei Raumtemperatur, um Kapside zu zerstören: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml 10% SDS </li><li> 2 mg Proteinase K </li></ul> Schütteln Sie diese Reagenzien zu mischen. Es sollte ein leichter Anstieg der Viskosität. </li></ol> Hüten Sie sich vor Scheren von hier aus, z. B. die Verwendung großer Bohrung Pipetten und nicht vortexen der viralen Material <ol start="2"><li> Auszug viraler Proteine ​​durch Zugabe von 5 ml Phenol-Chloroform und beginnt sofort mit Invertieren oder Vortexen, um eine Emulsion zu erhalten. Mix für 10 Sekunden, dann Zentrifuge die Emulsion für 5 Minuten bei 2000 rcf bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze, die Vermeidung der Schnittstelle und die Übertragung in ein neues Röhrchen Optional:. Verwenden Phase Lock Gel (PLG) Rohre in diesem Schritt, um eine Verunreinigung von der Oberfläche zu vermeiden. </li><li> Wiederholen Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Nach dem zweiten Phenol-Chloroform-Extraktion, sammeln die oberste Schicht in eine 30 ml Glas Corex Röhrchen und Chill das Rohr bei -20 ° C für 10-15 Minuten, wobei darauf geachtet, dass sie nicht einfrieren. </li><li> 10 ml eiskaltem Ethanol, decken das Rohr (z. B. durch Recken ein Stück Parafilm M over the top) und invertieren, um sofort zu mischen. Achten Sie auf eine DNA &quot;Geist&quot; zu erscheinen, die aus einer dünnen klebrigen Niederschlag besteht. Das Röhrchen vorsichtig weiter vermischen und verursachen den klebrigen DNA ausfällt, um die Cluster zusammen. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Haken, um die DNA ghost (s) zu erfassen. Sorgfältig Blot die DNA, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, dann setzen Sie den Haken (Spitze nach unten) in ein 1,5 ml-Tube und trocknen lassen. Add 0,25 bis 0,5 ml TE, um die DNA Geist aufzulösen. Lassen Resuspension der DNA für mindestens 1 Stunde vor. DNA bei 4 ° C. Optional: Um DNA-Ausbeute zu maximieren, brechen das Glas Haken in die 1,5-ml-Tube kann, so dass Resuspension von der Glassplitter im Laufe der Zeit weiter. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Bei einer ausreichend hohen MOI, sollten die Zellen vollständig CPE innerhalb von ~ 18 Stunden nach der Infektion (HPI) zu erreichen für Wildtyp-PRV-Stämme, und ~ 24 hpi für Wildtyp-HSV-1-Stämme (Abbildung 1). Sobald das infizierte Zellpellet geerntet wird, können die verbleibenden Schritte-Protokoll vollständig in einem langen Tag oder sich über zwei Tage (Abbildung 2). Bei der Vorbereitung Glas Haken an der DNA Geist zu erfassen, ist es wichtig, den Haken Winkel weniger als 90 Grad, so dass sie später in die Basis eines 1,5-ml-Tube (Abbildung 3) passen. Die Abdichtung der Spitze dieses Hakens verhindert DNA-Verlust in der Pipette. DNA Geister Form bei der Fällung und wird als weiße, zähe Fäden (Abb. 4) erscheinen. Diese aggregieren und kleben aneinander und / oder das Glas Haken benutzt, um die DNA zu erfassen. So das gleiche Glas Haken kann verwendet werden, um aufzusammeln mehrere Threads von DNA aus dem Niederschlag Lösung sein. <table border="1"><tbody><tr><td> Wählen Sie Spalte auf das gewünschte Volumen: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 pl </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 pl </td><td> 15 ul </td><td> 20 pl </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol (unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt) </td><td> 4,3 ul </td><td> 6,5 ul </td><td> 8,6 ul </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Verwenden Anteile für gewünschte Prozent Glycerin (0, 5 oder 45%) </td></tr><tr><td> 0% Glycerin </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% Glycerin </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Rezepte für die Zubereitung von LCM-Puffer <table border="1"><tbody><tr><td> Für 50 ml Volumen </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorbereitung der TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Für 1 Liter </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O auf 1L </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Herstellung des PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl und 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> Abbildung 1. PK15-Zellen (A) vor der Infektion, (B) auf halbem Wege durch Infektion und (C) auf zytopathischen Effekt (CPE), nachdem eine hohe Multiplizität der Infektion. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> Abbildung 2. Überblick über das Protokoll. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> Abbildung 3. Drei repräsentative Beispiele aus Glas Haken benutzt, um die virale DNA Geister zu sammeln. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für eine wohlgeformte und reichlich DNA &quot;Geist&quot;.

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Teile dieses Protokoll wurden ursprünglich für die virale DNA-Isolierung in BSL4 Bedingungen entwickelt, aber es passt ebenso gut auf nicht-BSL Bedingungen. 4 Wir verwenden häufig dieses Protokoll, um DNA aus den Alpha-Herpesviren PRV und HSV-1, das DNA-Genome sind zu isolieren eingeschlossen in einem proteinhaltigen Kapsid, umgeben von einer Lipid-Hülle. 7,8 Jedoch ist es wahrscheinlich, direkt anpassungsfähig zu anderen großen DNA-Viren, wie zB Beta-und Gamma-Herpesviren und Adenoviren. Äh...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) </td><td> Fischer </td><td> T178-4 </td><td> Erkundigen Sie sich bei Ihrer Institution Richtlinien zur angemessenen Entsorgung von Freon-haltigen Abfällen, oder sehen Sie Mendez et al. für potenzielle Freon Alternativen. 9 </td></tr><tr><td> Phase Lock Gel Röhrchen, Heavy 15ml Kapazität </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Fakultativ </td></tr><tr><td> Polyallomer Ultrazentrifuge Rohre </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Wählen Sie Röhren für Ihre eigenen Ultrazentrifuge, diese sind nur als Beispiel enthalten </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Viren sind obligate Parasiten zellulären und damit die Untersuchung ihrer DNA erfordert Isolierung viraler Material vom Wirtszelle Verunreinigungen und DNA. Mehrere nachgelagerten Anwendungen erfordern große Mengen an reiner viraler DNA, die durch dieses Protokoll vorgesehen ist. Zu diesen Anwendungen zählen virale Genom-Sequenzierung, in denen die Beseitigung der Wirts-DNA ist entscheidend für die Datenausgabe für virale Sequenzen zu optimieren und die Produktion neuer viraler rekombinanten Stämmen, wo Co-Transfektion von gereinigter Plasmid-und lineare virale DNA erleichtert Rekombination. 1,2, 3 Dieses Verfahren verwendet eine Kombination von Extraktionen und Dichte-basierte Zentrifugieren zu isolieren gereinigten linearen Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. 4,5 Die ersten Reinigungsschritte Ziel gereinigten viralen Kapside zu isolieren, die enthalten und schützen die virale DNA während der Extraktion und Zentrifugationsschritte dass zelluläre Proteine ​​und DNA zu entfernen. Lysis von Nukleokapside gibt dann die virale DNA, und zwei abschließende Phenol-Chloroform Schritte entfernen verbleibenden Proteine. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist hoch konzentriert und rein, mit einer durchschnittlichen OD 260/280 von 1,90. Je nach der Menge der infizierten Zellen verwendet, die Erträge der viralen DNA-Bereich von 150 bis 800 ug oder mehr. Die Reinheit dieser DNA macht es stabil während der Langzeit-Lagerung bei 4C. Diese DNA ist somit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen geeignet. Vor Beginn des Protokolls, ist es wichtig, die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Schale (z. B. durchschnittlich 8 x 10 6 PK-15-Zellen in einer konfluenten 15 cm Schale), und der Titer der viralen Lager verwendet werden wissen ( zB 1 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten pro ml). Diese sind notwendig, um die entsprechende Multiplizität der Infektion (MOI) für das Protokoll zu berechnen. 6 Zum Beispiel, um eine 15 cm Schüssel mit PK-15-Zellen mit den oben genannten viralen Lager, bei einer MOI von 5 infiziert, würden Sie 400 ul viralen Lager und verdünnen Sie es mit 3,6 ml Medium (insgesamt Impfung Volumen von 4 ml für eine 15 cm-Platte). Mehrere virale DNA-Präparate können zur gleichen Zeit vorbereitet werden. Die Anzahl der gleichzeitigen Vorbereitung ist nur durch die Anzahl der Rohre durch die Ultrazentrifuge Rotor statt Limited (einer pro-Virus; siehe Schritt 3,9 unten). Hier beschreiben wir das Verfahren, als ob die für einen Virus getan.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K Aufrufe.  Princeton University. Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Serie: Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...