Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI56168, AI71142, AI87541 und AI100631 zu MDP unterstützt. Maurizio del Poeta ist Burroughs Wellcome Investigator in Infectious Diseases.

1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO &amp; sub2; O / N. </li><li> Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die gefiltert und autoklavierbar ist. </li><li> Fügen Sie 200 ul MßCD Lösung in der gewünschten Konzentration (10 mM oder 30 mM in PBS) oder 1x PBS als Kontrolle und Inkubation für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln. Überstand entfernen und Reserve bei RT für die quantitative Analyse mit im Handel erhältlichen Kits unmittelbar nach dem Eingriff. </li><li> Mit 1x PBS oder serumfreiem DMEM Waschen Sie die Zellen zwei bis drei Mal und fahren Sie mit Infektion oder Lyse von Zellen pipetting zwei bis drei Mal mit deionisiertem H 2 O für die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie oder mit einem Kit. HINWEIS: Nach Cholesterinabbau ein kommerziell erhält Cholesterin Quantifizierung Kit kann verwendet werden. Siehe Materialien Abschnitt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers geschrieben. </li></ol> 2. Beobachtung von Cholesterin Inhalt von Dünnschicht-Chromatographie (TLC) <ol><li> Zweimal mit Aceton und einmal zu waschen eine TLC-Tank mit einer Lösung von Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen). Sättigen den Tank mit dem Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen) Lösung und lassen O / N. HINWEIS: Organische Lösemittel sollten immer unter einer Abzugshaube verwendet werden, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern. Handschuhe und Labormantel müssen immer getragen werden. Essigsäure ist eine starke Säure und sollte mit Vorsicht verwendet werden. </li><li> In einer sterilen Biosicherheitswerkbank, Samen 10 6 J774A.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-cell Kulturplatte in einem Volumen von 5 ml warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2 bis 1,4, und ersetzen Sie 1 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. </li><li> Fügen Sie 500 ul Trypsin-EDTA in jedes Loch, Inkubation für 3 min bei 37 ° C, und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. </li><li> Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und zusätzlich 500 ul warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 300 g und Überstand. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 500 ul warmes DMEM mit 10% FBS und 1% P / S zu dem Zellpellet ergänzt und sorgfältig resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und zählen Zellen auf einem Hämozytometer. Normalisieren die Zellkonzentrationen von jeder Probe, und fügen Sie die gleiche Anzahl von Zellen auf Glasröhren. HINWEIS: Bei diesem Schritt ist, kann manwählen, um Zellen, die aus den gleichen Behandlungsgruppen zu kombinieren, um eine stärker konzentrierte endgültige Lipidextrakt zu erhalten. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT inkubiert und das Medium entfernt. </li><li> 2 ml Methanol und Wirbel. Dann fügen Sie 1 ml Chloroform und Wirbel. Überprüfen Sie die Phasenlage um sicherzustellen, dass die Lösung in einphasigen machen. HINWEIS: Die Schläuche können bei 4 ° CO / N gespeichert werden. </li><li> Zentrifuge bei 1.700 xg für 10 min bei RT und den Überstand in ein neues Röhrchen </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 1 ml Chloroform, gefolgt von 1 ml dH 2 O Vortex zweimal für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1.700 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Wiege eine Glasröhre auf einem empfindlichen Gleichgewicht und einen Glas-Pasteur-Pipette, um die Unterphase in das Glasrohr mit bekanntem Gewicht zu übertragen. </li><li> Trocknen Sie nach unten Lipiden in einer Zentrifugalverdampfer bis trocken (ca. 2 h). Wiegen Rohr mit getrockneten Lipide und berechnen Sie die trockene Lipidgewicht. HINWEIS: Dry Lipide können in -20 ° C bis zu seiner TLC führen gespeichert werden. </li><li> Verdünne getrockneten Lipide in Chloroform ausreichend, um die Konzentration von Lipid zu normalisieren (üblicherweise 20-50 ul) und der Last 20 ul der verdünnten Lipid auf eine Kieselgel-DC-Platte. Last 20 ug Cholesterin in 20 ul Chloroform als Standard verdünnt. </li><li> Fügen getrocknet DC-Platte auf den gesättigten TLC Tank und lassen Sie Lösungsmittel für die Migration von bis zu 1 cm vor der Plattenkante. Entfernen DC-Platte aus dem Tank und lassen Sie es ca. 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Visualisieren Lipide, indem in einem Joddampf Tank Migration überprüfen. Entfernen Sie und lassen Sie Flecken auf etwa 10 verblassen - 15 Minuten unter der Haube. HINWEIS: Jod ist ein Inhalationsrisiko. Verwenden Sie immer unter einer Abzugshaube. </li><li> Es wird eine Lösung für die Neutrallipid-Anfärbung durch Kombinieren von 60 ml Methanol mit 60 ml entionisiertem H 2 O, 4 ml Schwefelsäure und 630 mg Manganchlorid. </li><li> Die DC-Platte vorsichtig und langsam tauchen in das neutrale Lipid Farblösung in einer Schale und ohne Abgleitens der Kieselsäure l entfernenayer. ANMERKUNG: Das neutrale Lipid Färbelösung kann mehrere Male wiederverwendet werden, und so kann sie aus dem Fach abgerufen und in einer Flasche zur späteren Verwendung zurück gelegt. </li><li> Lassen Sie die Platte unter die Haube bei RT trocknen, bis alle Blasen verschwunden. Erhitzen Sie die DC-Platte auf einem Heizblock Satz bis 160 ° C und Saibling auf die gewünschte Farbe. HINWEIS: Eine Dichtemessung Programm wie Sehen funktioniert LS kann zur Quantifizierung der verkohlten Bands Lipidproben zu vergleichen. </li></ol> 3. Die Infektion von Makrophagen mit C. neoformans (H99) <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. HINWEIS: Die Infektion kann auch in Glas ausgeführt werden Talsohle konfokalen Gerichte für einfachere Bild; Alle Beträge bleiben gleich. </li><li> Wachsen einer Kultur der C. neoformans (H99)durch Inokulation von 10 ml YNB mit einer Kolonie von einem geschlagen Platte erhalten und Inkubation O / N bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Waschen Sie und zählen C. neoformans (H99) Zellen. <ol><li> Centrifuge C. neoformans O / N-Kultur bei 1700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Medium und entsorgen. Wash-Zellen mit 5 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> PBS entfernen und wäscht mit 5 ml gefiltert 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. </li><li> Entfernen PBS und Resuspendieren in 5 ml 1x PBS. </li><li> Stellen Sie eine serielle Verdünnung in PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 Verdünnung der Kultur gewaschen. <ol><li> Füge 100 ul der ursprünglichen Probe zu 900 ul 1x PBS, um eine Verdünnung von 1:10 zu erhalten. </li><li> 100 l 1:10 verdünnten Probe zu 900 ul 1X PBS, um eine 1 zu erhalten: 100-Verdünnung. </li><li> Gib 200 ul der 1: 100 verdünnt Probe auf 800 &amp; mgr; l 1x PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 dilutiauf </li></ol></li><li> Nehmen Sie 10 ul einer 1: 500-Verdünnung und zählen auf Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu berechnen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung für die Aktivierung von Makrophagen und opsonisierenden C. neoformans. <ol><li> Verdünnen LPS und IFN 100x aus Stammlösungen durch Zugabe von 10 ul bis 990 ul. HINWEIS: LPS und IFN &amp; ggr; werden verwendet, um Phagozytose zu verbessern, sind jedoch nicht für die Phagozytose erforderlich. Wenn es ein Interesse an der fungiziden Aktivität von Makrophagen, führen Aktivierungs O / N bei 37 ° C mit Schütteln vor der Infektion. </li><li> Pro Probe kombinieren 7,5 ul verdünnt LPS, 1,25 &amp; mgr; l verdünnt IFNy, 1,25 ul GXM Antikörper und das Volumen des C. neoformans Kultur, die 1,25 x 10 5 Zellen gibt. Bringen Volumen bis zu 250 &amp; mgr; l multipliziert mit der Anzahl von Proben mit DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Vortex und Inkubation Lösung für 20 min bei 37 ° C unter Schütteln. HINWEIS:Cholesterinabbau (Schritte von 1,2 bis 1,4) kann gleichzeitig mit der Opsonisierung Schritt erfolgen. Achten Sie darauf, Makrophagen vor dem Kombinieren der Arbeitslösung zu behandeln, da die opsonisierte Zellen sind optimal zu nicht mehr als 20 min nach dem Schritt 3.4.3 Inkubation verwendet werden. </li></ol></li><li> Infizieren Makrophagen <ol><li> Wash Makrophagen zweimal mit serumfreiem DMEM und fügen Sie 200 ul opsonisierten C. neoformans Arbeitslösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix und Stain Cells <ol><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2 mal mit DMEM. </li><li> Luft trocknen die Zellmonoschicht für 10 Minuten und mit 200 ul eiskaltem Methanol, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Inkubieren für 15 min bei RT und entfernen Sie alle verbleibenden Methanol. </li><li> Fügen Sie 200 ul von 10x Giemsa und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Mit VE-Wasser und trocken O / N mit Kappe aus 3 mal - Waschen 2. HINWEIS: Imaging können am nächsten Tag bis zu einer Woche followi erfolgen oder bisng-Färbung. </li></ol></li><li> Visualisieren und Graf <ol><li> Mit einem Mikroskop, zählen 300 Zellen pro Datenpunkt (bei ​​2 von der gleichen Behandlung zählen 150 pro Vertiefung), und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen und Anzahl der verschlungen Cryptococcus Zellen. HINWEIS: Wenn Sie auch sicher, Probenahme pro Datenpunkt Einsatz 2 Platten pro Bedingung, wählen Sie 3 nicht überlappende Bereiche pro Platte und zähle 50 Zellen pro Fläche. </li><li> Berechnen phagozytischen Index, indem der Prozentsatz der infizierten Makrophagen durch die mittlere Anzahl von C neoformans pro Makrophagen. Normalisieren phagozytischen Index ausdrückt Werte als ein Prozentsatz des 1x PBS behandelten Kontroll. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts, um Trends in phagozytischen Index zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li><li> Nehmen Sie Aufnahmen von Zellen bei 1,000x oder 400-facher Vergrößerung. </li></ol></li></ol> 4. Trypanblau-Assay <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 6 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-Zellkultur-Platte in einem Volumen von 5 ml Dulbecco-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt . Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2-1,4 daß 2 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Steuerung mit 1x PBS sowie eine Steuerung, die vor jeder Behandlung gekratzt behandelt sind. </li><li> Gib 500 ul 1x PBS in jede Vertiefung und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und die Zellen zu suspendieren durch leichtes Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und Fleck mit 1 ul 4% Trypanblau. </li><li> Zählen von Zellen an einem Hämozytometer und berechnen die Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% Lebensfähigkeit = [1 - (blaue Zellen / Gesamtzellen)]x 100. Normalisieren Werte an die Steuerung, die unbehandelt war. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung zu Trends in der Lebensfähigkeit zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lan...

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper 1 zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional &quot;Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome 2 zu signalisieren. Unter den so genannten &quot;professionellen&quot; Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose 1,2. Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen 3 gezeigt, 4. Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich 5 erleichtern - 8. Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die &quot;Trojanisches Pferd&quot; Modell 3,9 überqueren - 11. Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen. Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose 12 spielen gebildet - 15. Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 - 50% der Säugerzelle Membran 16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit 17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs 16 beteiligt - 18. Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen 18 zu studieren. In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran 19 zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) 20 gemessen. . 23 - Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper 21 opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Class II type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td style="width:120px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">3460009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">J774A.1 cell line</td>
			<td style="width:120px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:167px;">Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082-147</td>
			<td style="width:167px;">Keep frozen at -20 &#176;C and thaw before adding to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;">Used to suplement DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Cell culture incubator</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # 3530</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well culture dish</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Methyl-&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">C4555-10G</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:120px;">Labline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12216</td>
			<td style="width:167px;">All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Black Assay plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FilterMax microplate reader</td>
			<td style="width:120px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model F5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TLC Chamber</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z126195-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650498-4L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34860-2L-R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TLC Paper</td>
			<td style="width:120px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">3030917</td>
			<td style="width:167px;">Cut down to size needed for TLC tank</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6-Well Plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1490</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:120px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model Alegra x-30R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Votex Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-812</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balance</td>
			<td style="width:120px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # MS104S Meaures down to .1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:120px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:120px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">700000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # SPD2010&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petroleum Ether</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E139-1&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">309966&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td>
			<td style="width:120px;">Analytical Chromatograhy Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1.11845.0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodine Chips</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">376558-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Manganese Chloride</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">244589</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UVP EC3 Imaging System</td>
			<td style="width:120px;">Ultra-Violet Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Bottom Confocal Dish</td>
			<td style="width:120px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-10C</td>
			<td>www.glassbottomdishes.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cryptococcus neoformans (H99)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Obtained from Duke University Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">YNB</td>
			<td style="width:120px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">239210</td>
			<td style="width:167px;">See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4391-1MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I4777</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Gift from Arturo Casadevall&#39;s Lab concentration is 1.98 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Giemsa</td>
			<td style="width:120px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194591</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 &#176;C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl - Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN &amp; gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.

Cholesterin Depletion Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Aufrufe.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Serie: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...