Name: collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
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저자는 제임스 포 세 모든 videography 및 비디오 처리; 그의 뛰어난 작품에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 디지털된 가축 이미지;의 세대에 그의 뛰어난 작품에 대 한 마이클 마티 릴리 아는 발터에 대 한 그녀의 RNA 추출 및 Bioanalyzer 실행; 미치 파머와 도움이 검토 및 림프 노드 이미지;에 대 한 피드백에 대 한 칼 리 Kanipe 동물 보호 그리고 그들의 노력 및 축산 지원의 모든 국립 동물 질병 센터와 차례의 준비에서 수의 직원 들.

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다. 모든 연구는 농업의 미국 학과, 농업 연구 서비스에서 교내 자금 투자입니다. 특정 제품에 대 한 모든 참조 실험의 재현성을 위해 제공 되 고 연방 정부에 의해이 제품의 모든 지지를 대표 하지 않는다.

마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항?...

림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상3.
실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RNA 그대로 RNA 생물학 관련 transcriptomic 데이터의 생성을 위해 필수적 이다. 조직 샘플에서 높은-품질 RNA의 생성은 특히 큰 동물 병원 체 연구에 대 한 중요 한 실시 제약 시설에서. 이러한 연구는 본질적으로 더 그들은 뿐만 아니라 시설 승인 및 고도로 훈련 직원 필요 하지만 상당한 금융 비용을 작업에 따라 수백 수천 달러의 수만에서 배열할 수 있다 수행를 수행 하기 어렵다. 이러한 유형의 연구는 또한 크로스-징계 협업 및 그들의 복잡성을 추가 하는 그들의 완성에 대 한 크로스-징계 지식을 포함 한다. 따라서,에 대 한 교육, 개발, 샘플 수집 및 보존에 대 한 효율적인된 시스템을 준수 하는 이득을 제공 한다 중요 한 조직의 다운스트림 분자 연구에 대 한 감염 된 동물에서.
큰 림프 노드의 컬렉션 murine 림프절의 유사한 샘플링에 비해 조직 컬렉션에 대 한 추가적인 도전을 선물 한다. 샘플 절단에 대 한 준비 관련 내부 구조를 포함 한 림프절의 해부학에 대 한 기본적인 이해를 필요로 합니다. 림프 노드의 구조는 림프 lobules sinuses 림프로 가득 둘러싸인 구성 됩니다. 이러한 구조는 거친, 섬유질 캡슐 포함. 4 림프 lobule "기본 해 부와 기능적인 단위 림프 노드의" 이며 낭, 깊은 외피 단위 및 골 수 코드와 sinuses4 (그림 1A)로 구성 됩니다. B와 T 세포는 각각 낭과 깊은 외피 단위에 가정. 이러한 구조 3D 비 계를 제공 하 고 있는 림프 톨 항 원 또는 항 원 제시 세포 사이 상호 작용 촉진.
조잡 한, 낭과 깊은 대뇌 피 질의 단위 확인할 수 있습니다 잘라 표면에 그들은 빽으로 채널을 포함 하 고 보다 더 섬세 한 망상 채널의 구성 되어 나타나고 라이터는 sinuses 표시 (그림 1B). 규칙에 따라 병리학 표면 피 질 (낭), paracortex (깊은 외피 단위)와 골 수 (골 수 코드와 sinuses) 림프절의 영역을 참조 하십시오. 모든 3 개의 영역의 적절 한 시험 간주 되었습니다 최고로 림프절5에 대 한 일상적인 병 적인 시험 지침에 연습. 참고 일관성, 크기, 및 단일 동물 내 에서도 림프절의 색상에 상당한 변이가 있다. 동물 나이, 그들의 림프절 크기 감소와 젊은 동물의 그들 보다는 더 확고 한 되, 일반적으로 그들의 결합 조직 및 림프 정상의 감소에서 증가로 인해6,7을 구조 하는 경향이 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> 그림 1. 림프절의 해부학. (A)이 만화 이미지 표시, 림프절의 해부학 키 구조를 묘사. (B)이 여전히이 이미지 횡단면으로 잘라 소 림프 노드를 보여 줍니다. 육안으로 볼 수 있습니다 관련 구조/레이어 강조 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
실험적인 질문에 따라 다른 림프절 수집 및 분석에 대 한 관심이 될 것입니다. 주변 림프절은 피하 조직에 깊이 있는. 가축, 주변 또는 표면 림프절 임상 및 실험 연습에서 자주 사용 한다 포함 귀 밑, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural)와 표면 사 타 구니 (supramammary 여성, 남성에서 음 낭에서) ( 그림 2)입니다. 표 1주요 표면 림프절의 속성 가축 시스템8에 설명 된 대로 설명 되어 있습니다. 아래 소의 세균성 전염병에 대 한 몇 가지 잠재적인 림프 노드 컬렉션 계획 조사에 대 한 시작 지점으로 제공 됩니다.
세라 abortus/세라 melitensis: 표준을 B. abortus위한 necropsies-가축 및 B. melitensis감염-감염 된 염소 국립 동물 질병 센터에서 supramammary, prescapular, 및 선 림프절 조직 복구 모두 호스트 RNA 식 프로 파일링에 대 한 RNA 준비를 위한 세균성 열거형에 대 한 분쇄. B. abortus 정기적으로 실험적으로 감염 된 가축9. 에 이러한 림프절의 각 재기 될 수 있다 B. melitensis에 이러한 림프 노드 형식 각각에 있는 박테리아의 존재를 검출 될 수 있다-우리의 연구 (Boggiatto 그 외 여러분, 미 출판)에서 RNA 기반 방법론을 사용 하 여 감염 된 후 적어도 9 개월까지 염소를 감염. 살 모 넬 라 sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), 그리고 mesenteric 림프절 살 모 넬 라 보급10,,1112 에 대 한 가축 시체를 프로 파일링 하는 동안 유용 하 게 되었습니다, transcriptomic 연구에 대 한 잠재적인 관심의 것입니다. E. 콜라이 O157:H7: (중간 소장 원심 소장 위치에서) Mesenteric 림프절 박테리아 감염 된 송아지 (에 감염 된 성인 가축)13의 가끔 회복의 사이트 수 있습니다. 렙 (Leptospira sp.): 박테리아의 만성 지 속성 유선14배출 림프절에서 관찰 되었습니다. 진 균 bovis : 가축, 박테리아 종 아리15의 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절에서 복구 된 후 실험 감염 되었습니다. 또한, 림프절 RNA 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스2등 큰 동물 호스트 응답을 검사 하 이용 되어 있다. 그림 2 는 가축 시체에서 이러한 주요 림프절의 하위 집합의 위치를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> 그림 2: 선택 된 림프 노드 위치를 묘사 하는 만화 보스 토 러 스 . 번호가 매겨진된 림프절은 주석 처리 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 문서와 관련 된 비디오, 선물이 큰 동물 감염의 transcriptomic 연구에 관련 된 분자 생물학에 대 한 유익 하도록 설계 된 RNA 연구에 대 한 큰 동물 림프절의 격리에 대 한 프로토콜. 먼저, 우리 제공 격리 절차의 개요, 림프절에 대 한 예제로 소과 들소 조직에서 샘플링을 사용 하 여. 와 결합 하 여이 데모 비디오에 표시 된 대로, RNA 격리에 대 한 재현 조직 샘플링에 대 한 워크플로우가 이다. 다음, 우리는 감염 된 림프절, 안전, 일관성, 그리고 RNA 품질에 초점을 맞춘의 처리에 대 한 중요 한 고려 사항을 설명합니다.
산성화 페 놀 guanidine isothiocyanate 시와 조직에서 RNA의 준비 Chomczynski 및 Sacchi16,17, 실리 카 기반 스핀 열의 존재에 대해 정화의 원래 방법에 따라 Vogelstein 길18의 원래의 작품에 따라 chaotropic 대리인. 우리는 또한 transcriptomics에 대 한 대체 방법으로 보존 하는 가축 림프절에서 RNA의 복구에 대 한 가능성을 검사 합니다. 마지막으로, 우리는 안락사와 들소에서 복구 된 RNA 프로 파일에 샘플링 사이의 시간 증가의 효과 묘사 하는 대표적인 실험을 포함 하 여 큰 동물 necropsies에서 RNA 품질에 시간 변수의 영향을 탐구 하 고 소 림프 노드입니다. 이 문서 뿐만 아니라 분자 생물학 하지만 transcriptomic 연구를 개시 하는 또한 하 수의 연구자에 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps, rat tooth</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td></tr><tr><td>3 mm punch biopsy needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container (small and transportable for necropsy)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. size shown here</td></tr><tr><td>Cutting boards or disposable trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td></tr><tr><td>Personal protective equipment</td><td></td><td></td><td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td></tr><tr><td>Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Designed for up to 100 mg tissue</td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (General, for gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Can also make from scratch in the laboratory</td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spreader (L-shaped spreader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td></tr><tr><td>Necropsy knives</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 대 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.

이 문서 (프로토콜의 단계 1-4)에서 제공 하는 고려를 사용 하 여 호스트 유전자 표현 연구에 다운스트림 분석 적합 큰 동물 샘플에서 RNA의 회복에 도움이 됩니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA 품질은 여러 표준 측정에 의해 평가 됩니다. 분 광 광도 학, 단백질 오염 물질의 측정을 제공 하는 A260/A280 비율 및 A260/A230 비율 순수성 평가 페 놀 등 화학 오염 물질...

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Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.3K 조회수.  U.S. Department of Agriculture. 이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

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Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

연구

생화학

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

유전학

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent pathways. Until recently, thermogenic adipocytes were considered a homogeneous population. However, recent studies have indicated that there are multiple subtypes or subpopulations that are distinct in developmental origin, substrate use, and transcriptome. Despite advances in single-cell genomics, unbiased decomposition of adipose tissues into cellular subtypes has been challenging because of the fragile nature of lipid-filled adipocytes. The protocol presented was developed to circumvent these obstacles by effective isolation of single nuclei from adipose tissue for downstream applications, including RNA sequencing. Cellular heterogeneity can then be analyzed by RNA sequencing and bioinformatic analyses.

This publication describes a protocol for the isolation of nuclei from mature adipocytes, purification by fluorescence-activated sorting, and single-cell level transcriptomics.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

암 연구학

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

면역학 및 감염병학

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

신경과학

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into sympathetic and parasympathetic branches. Normally, there is a balance between these two branches to maintain homeostasis. However, cardiac disease states such as myocardial infarction, heart failure, and hypertension can induce the remodeling of cells involved in cardiac innervation, which is associated with an adverse clinical outcome.
Although there are vast amounts of data for the histological structure and function of the cardiac autonomic nervous system, its molecular biological architecture in health and disease is still enigmatic in many aspects. Novel technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) hold promise for the genetic characterization of tissues at single-cell resolution. However, the relatively large size of neurons may impede the standardized use of these techniques. Here, this protocol exploits droplet-based single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq), a method to characterize the biological architecture of cardiac sympathetic neurons in health and disease. A stepwise approach is demonstrated to perform snRNA-seq of the bilateral superior cervical (SCG) and stellate ganglia (StG) dissected from adult mice.
This method enables long-term sample preservation, maintaining an adequate RNA quality when samples from multiple individuals/experiments cannot be collected all at once within a short period of time. Barcoding the nuclei with hashtag oligos (HTOs) enables demultiplexing and the trace-back of distinct ganglionic samples post sequencing. Subsequent analyses revealed successful nuclei capture of neuronal, satellite glial, and endothelial cells of the sympathetic ganglia, as validated by snRNA-seq. In summary, this protocol provides a stepwise approach for snRNA-seq of sympathetic extrinsic cardiac ganglia, a method that has the potential for broader application in studies of the innervation of other organs and tissues.

This protocol describes the detailed, low-input sample preparation for single-nucleus sequencing, including the dissection of mouse superior cervical and stellate ganglia, cell dissociation, cryopreservation, nucleus isolation, and hashtag barcoding.

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

의학

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

생물학

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

인간 신장 조직에서 지역 전사학을 밝히기 위해 레이저 미세 절제술의 응용 프로그램

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...