Diese Methoden integrieren die Sequenzierung der nächsten Generation und die Bildgebungsanalyse der Durchflusszytometrie. Es kann helfen, interessante Fragen zu beantworten, wie z. B. ob einige phänotypische Veränderungen impliziert sind, anstelle des Transkriptoms, vor allem in der Umwelt der Schadstoffbelastung. Der Hauptvorteil dieser einfachen Methode für uns ist, dass wir sie verwenden können, um die Kolokalisierung von biologisch wichtigem Protein zu messen, um die Ergebnisse der wichtigsten Differentialgenexpression auf funktioneller Ebene zu interpretieren.
Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose pathologischer und toxikologischer Ergebnisse. Als normaler Imager-Ansatz hat Forsee die Fähigkeit, genexpression mit der Proteinfunktion zu verbinden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der hohen technischen Anforderungen der bildgebenden und transkriptomischen Analyse Schwierigkeiten haben.
Um die menschliche Monozyten-abgeleitete dendritische Zellbibliothek zu sequenzieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungs- und Indexierungsreagenzien auf die Sequenzierungsbiosynthese- bzw. Indexierungsreagenz-Racks und legen Sie die Regale für eine Stunde in ein Laborwasserbad, bis das gesamte Eis geschmolzen ist und die Reagenzien gründlich gemischt werden. Während die Reagenzien auftauen, schalten Sie den Sequenzer ein, schließen Sie den Computer an ein Netzlaufwerk an, wenn das Laufwerk Nicht auswerfen, und starten Sie die Sequenzersteuerungssoftware. Als nächstes fügen Sie etwa 100 Milliliter Wartungswaschlösung zu jeder der Flaschen in der Sequenzierung Biosynthese Reagenz Rack, und schrauben Sie eine Trichterkappe auf jede Flasche.
Fügen Sie etwa 12 Milliliter Wartungswaschlösung zu jedem 15 Milliliter konischen Rohr im Indexierungsreagenzgestell hinzu, und entsorgen Sie die Kappen. Dann laden Sie beide Racks auf den Sequenzer. Wählen Sie Maintenance Wash in der Sequenzersteuerungssoftware aus, und befolgen Sie die Anweisungen zur Reinigung des Sequenzerflüssigkeitssystems.
Verwenden Sie eine Taschenlampe, um die Durchflusszelle visuell auf Blasen zu untersuchen, die durch die Fahrspuren gehen, um sicherzustellen, dass es keine Leckagen gibt. Wenn die Waschsequenz abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Sequenz, und starten Sie eine neue Ausführung, um die Ausgabedaten an ein Netzlaufwerk weiterzuleiten. Laden Sie ein Beispielblatt zum Entmultiplexing hoch, und geben Sie die entsprechenden Reagenzinformationen ein.
Verwenden Sie eine verwendete Durchflusszelle, um das System mit den Sequenzierungsreagenzien zu grundieren. Sobald die Clustergenerierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Durchflusszelle. Und die Zelle leicht mit Wasser besprühen.
Wischen Sie die Durchflusszelle trocken mit Linsenpapier ab, gefolgt von einem Lichtspray mit 95% Ethanol. Nachdem Sie die Durchflusszelle wieder trocken gewischt haben, überprüfen Sie die Oberfläche der Durchflusszelle mit dem Licht, um sicherzustellen, dass sie sauber ist, ohne Schmutz oder Salzrückstände. Wenn der Hauptschritt abgeschlossen ist, laden Sie die gruppierte Durchflusszelle, und beginnen Sie mit der Sequenzierung.
Die Sequenzanalyse-Viewer-Software wird automatisch gestartet. Überwachen Sie etwa 26 Stunden später die Datenqualität der Sequenzierung über die Software für die hohe Sequenzsteuerung und die Analyseansichtssoftware, um die Datenqualität zu bewerten und die Fehlerbehebung zu beheben. Wenn die Sequenz abgeschlossen ist, ändern Sie dann die Durchflusszellendichtung, und führen Sie eine Wartungswäsche durch, bevor Sie mit dem nächsten Durchlauf beginnen.
Nach der zytometrischen Bildgebung der schadstoffexponierten dendritischen Zellen öffnen Sie ImageJ Fidschi und verschmelzen Die 100 gespeicherten Zellbilder für die nicht exponierten und schadstoffexponierten menschlichen dendritischen Zellprobengruppen entsprechend der Behandlungsgruppe in einzelnen Dateien. Um CD1d und Lamp1-Kolokalisierung innerhalb der beiden Populationen zu analysieren, öffnen Sie das schadstoffbelichtete 100 zusammengeführte Zellbild, und wählen Sie Bild, Farbe und Split-Kanäle aus, um das Bild in zwei einzelne Bilder mit einem einzelnen Fluorophor pro Kanal aufzuteilen. Um ein Streudiagramm der kolokalisierten Pixel zu erstellen, wählen Sie Analysieren, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus, und drücken Sie Druckbildschirm, um das Streudiagramm zu speichern.
Um den Kolokalisierungskoeffizienten des Manders für jedes einzelzelluläre Bild zu berechnen, verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug, um ein Einzelzellenbild in der Bilddatei mit den geteilten Kanälen auszuwählen, und wählen Sie erneut Analyse, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus. Wählen Sie dann Kanal 1 aus dem Dialogfeld für die Interessenregion aus, und klicken Sie auf OK. Wenn der Koeffizient für alle 100 Zellbilder berechnet wurde, importieren Sie die Ergebnisse in eine entsprechende Kalkulationstabelle, und wiederholen Sie die Analyse für die nicht verfügbar gemachte Zellenprobe. Mithilfe von RNA-Sequenzierung und transkriptomischen Datenanalysen wurden mehrere wichtige veränderte Gencluster, einschließlich Lipidstoffwechsel und endozytäre Funktionen, in den schadstoffexponierten DCs identifiziert.
Auf der individuellen Zellbildebene können HLADR-positive CD11c-positive dendritische Zellen gemäß ihrer CD1d- und Lamp1-Koexpression abgezäut werden. Kontrollieren Sie nicht exponierte dendritische Zellen zeigen minimale CD1d- und Lamp1-Proteinkolokalisierung, was auf einen basalen Gehalt an CD1d-Endozytikerhandel und eine hohe Oberflächenexpression unter physiologischen Bedingungen hinweist. Während CD1d in den späten endozytischen Kompartimenten von schadstoffexponierten dendritischen Zellen aufbewahrt wird, bestätigt sich die samtytischen Genprofile in dieser experimentellen Zellpopulation.
Nach dem Zusammenführen der einzelnen Zellbilder in eine einzelne Bilddatei können die einzelnen Bilder entsprechend ihrem Fluorophorausdruck aufgeteilt und die Kolokalisierung der Pixelintensität zwischen den beiden Kanälen in einem Streudiagramm visualisiert werden. Der Grad der Kolokalisierung zwischen den CD1d- und Lamp1-Proteinen in den beiden Behandlungsgruppen kann dann mit Mander-Koeffizienten quantifiziert werden. Wenn die Proteinintensität zwischen den kolokalisierten und nicht-kolokalisierten Bereichen hetergenes ist, wird die kolokalisierte Intensität nicht parallel zu den kolokalisierten Bereichen sein, daher ist es auch wichtig, die Kolokalisierung der beiden Proteine auf der Grundlage der Pixelintensität weiter zu bewerten.
Nach der Beherrschung kann die Bildanalyse in zwei Stunden abgeschlossen werden, und die RNA-Sequenzierung kann in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn jede Technik ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzuvergessen, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß in den richtigen Positionen geladen sind und dass es keine Leckage im Sequenzer gibt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Mikro-RNA, Exom oder Mastzellsequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur globalen Mikro-RNA-Expression, Genmutation bzw. DNA-Methylierung zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der zellulären Bildgebungsanalyse und der Sequenzierung der nächsten Generation helfen, die Auswirkungen des Umweltschadstoffs auf die Genexpression und die Proteinfunktion zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sequenzierung der nächsten Generation und die Imageranalyse der Proteinkolokalisierung einrichten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem giftigen Schadstoff Chemikalien in menschlichen Blutproben extrem gefährlich sein kann.
Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer chemischen Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden.
