Diese Methode hat wichtige Fragen auf dem Gebiet beantwortet, wie ein menschliches Leber chimer Mausmodell zu generieren, familiäre Hypercholesterinämie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Durchführung von Drogentests in in vivo ermöglicht. Diese Technik hat Syndizierung für die Behandlung von familiärer Hypercholesterinämie.
Als neue Therapie für diese Krankheit, Kann es mit solchen chimer Tiermodellen getestet werden. Obwohl diese Methode Einblick in familiäre Hypercholesterinämie bieten kann, Es kann auch auf andere vererbte Lebererkrankungen angewendet werden. 24 Stunden vor der Transplantation 40 Mikroliter extrazelluläre Matrix pro Maus auftauen, indem Sie sie in einer Eisbox in einem kalten Raum aufstellen.
Kühlen Sie eine Insulinspritze für jede zu injizierende Maus und eine Box mit 200 Mikroliter Spitzen in einem Vier-Grad-Kühlschrank Celsius. Eine Stunde vor der Engraftment, erwärmen Sie das Zelldissoziationsenzym, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter DNAase 1, auf Raumtemperatur und platzieren RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 20 Prozent Serumersatz auf Eis. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder von iHeps, um ihren Status aufzuzeichnen, einschließlich Zellmorphologie, Wachstum und Zelldichte.
Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen von iHeps mit 2 Milliliter Raumtemperatur Kalzium und Magnesium ionfreie PBS zweimal und fügen Sie dann einen Milliliter des vorgewärmten Zelldissoziationsenzyms zu jedem Brunnen hinzu. Geben Sie die Zellen für acht bis zehn Minuten in den Inkubator zurück. Überwachen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop.
Wenn die meisten Zellen rund werden, fügen Sie in gleichem Volumen des kalten Mediums pro Brunnen, Pipette die Zellen sanft von der Platte zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension zu einem neuen 15 Milliliter Rohr. Dieser Schritt ist entscheidend für die Zuverlässigkeit der Hepatozyten. Wenn die Zellen schwer von der Platte zu lösen sind, können einige auf der Platte gelassen werden.
Und wenn sich die Zellen lösen, dann Pipette sanft nach der Zentrifugation, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Wiederholen Sie den Zellablösungsvorgang für jeden Brunnen, bis fast alle angeschlossenen Zellen gesammelt sind. Dann Zentrifuge bei 200 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit zwei Milliliterkaltem PBS in der 15 Milliliter-Röhre wieder auf. Pipette die Zellen sanft, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Übergeben Sie dann die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um Aggregate zu entfernen.
Normalerweise können ein bis zwei Millionen Zellen nach wenigen Minuten geerntet werden. Als nächstes fügen Sie Mikroliter von 0,4 Prozent Trypan blue Lösung zu 20 Mikroliter Zellsuspension hinzu. Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Konzentration der Zellsuspension als C.Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension, um eine Million Zellen pro Maus zu injizieren.
Dann das benötigte Volumen der Zellsuspension in 15 Milliliter-Röhren und Zentrifuge bei 200 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius zuordnen. Nach dem Entfernen des Überstandes, setzen Sie die Zellen in 27,5 Mikroliter kalte PBS pro Maus wieder auf. Und dann fügen Sie ein gleiches Volumen der extrazellulären Matrix für ein endgültiges Volumen von 55 Mikroliter pro Maus hinzu.
Legen Sie nun eine der kalten Insulinspritzen auf Eis. Ziehen Sie den Kolben ab, übertragen Sie 55 Mikroliter Zellaufhängung in die Spritze und legen Sie den Kolben zurück. Blasen vorsichtig entladen und die Spritze wieder auf Eis legen.
Stellen Sie sicher, dass LRG-Mäuse ordnungsgemäß anästhesien, bevor Sie mit der Injektion beginnen. Tragen Sie die tierärztliche Salbe über die Augen auf, um Trockenheit während des Anästhesieverfahrens zu verhindern. Sobald die Maus den Muskelreflex zur Stimulation verloren hat, legen Sie sie in die rechte, seitliche, dekubitus Position.
Tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf den Schnittbereich in der linken Flanke auf und lassen Sie sie fünf bis acht Minuten lang stehen. Entfernen Sie die Enthaarungscreme und das Haar, indem Sie den Bereich mit einem wasserbefeuchteten Gazepad abwischen. Scheuern Sie die linke Flanke mit 70 Prozent Ethanol dreimal.
Dann finden Sie die Milz, die in der linken Flanke zu sehen ist. Gefolgt von einem abschließenden Einweichen mit Betadine zur Desinfektion. Nach der Verwendung der Schere, um einen 0,5 bis 1 Zentimeter Schnitt in der Haut und Bauchwand zu machen, verwenden Sie Zangen, um die Milz zu exteriorisieren, indem Sie das umgebende Fettgewebe sanft ziehen.
Die Milz mit einem Tupfer vorsichtig stabilisieren. Setzen Sie die Nadel der Insulinspritze drei bis vier Millimeter in das Parenchym der Milz ein und injizieren Sie vorsichtig etwa 50 Mikroliter Zellsuspension. Ziehen Sie die Nadel ein und legen Sie einen Wattestäbchen eine Minute lang über die Injektion, um Blutungen und Verschüttungen von Material zu verhindern.
Geben Sie die Milz in das Peritoneum zurück und schließen Sie die Wunde mit fünf-oh Nylon Nähten. Nach dem Nähen, legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser. Beginnen Sie, indem Sie die inneren Organe von der frisch eingeschläferten Maus entfernen, so dass die absteigende Aorta, parallel zur Wirbelsäule, sichtbar ist.
Dann sezieren Sie das benachbarte Gewebe, und entfernen Sie das Herz. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Aortae zu sezieren, indem Sie jede einzelne in kalte, sauerstoffhaltige Krebslösung setzen. Nach der Entnahme die Aortae in Krebs-Lösung auf eine silikonbeschichtete Petrischale übertragen.
Pin das Bindegewebe, um die Aorta-Position zu fixieren, ohne sie zu dehnen. Unter einem sterilen Mikroskop, verwenden Sie feine Zangen und Federschere, um die Aorta frei von dem umgebenden Fett und adventlichem Gewebe zu sezieren, ohne die Gefäßwand zu beschädigen. Schneiden Sie dann jede Aorta in eineinhalb bis zwei Millimeter lange Segmente.
Als nächstes schneiden Sie ein zwei Zentimeter langes Stück mit 40 Mikrometer dickem Edelstahldraht und legen Sie es vorsichtig in das Aorta-Lumen ein. Halten Sie den Draht, um das Segment in die drahtige Myographenkammer zu übertragen, die mit sauerstoffhaltiger Krebslösung gefüllt ist. Um die Länge der Aortaesegmente beim Studium der Kontraktilität zu messen, platzieren Sie jedes Segment senkrecht zwischen den Kiefern, und notieren Sie den D1-Wert auf dem Mikrometer.
Entfernen Sie dann das Segment und bewegen Sie die Backen zusammen. Zeichnen Sie den D0-Wert auf und berechnen Sie die Länge des Segments. Als nächstes klemmen Sie den Draht ein und befestigen Sie ihn mit dem Schraubendreher, während Sie das ungestreckte Segment zwischen den Backen platzieren.
Für die Normalisierung vor dem Experiment, setzen Sie den Myographen auf Null in der ungestreckten Position. Dann bewegen Sie langsam die Kiefer auseinander und beobachten Sie die Aorta-Spannung ändern, bis drei Millinewton erreichen. Nach 15 Minuten die Lösung aus der Myographenkammer abtropfen lassen und durch eine frische Krebslösung ersetzen.
Nachdem Sie weitere 15 Minuten gewartet haben, stellen Sie die Spannung erneut auf drei Millinewton ein. Dann ändern Sie die Standard-Krebs-Lösung auf Krebs-Lösung mit 60 Millimolaren Kaliumchlorid ergänzt, um Kontraktion für mindestens fünfzehn Minuten zu induzieren. Spülen Sie mit frischer Krebs-Lösung dreimal, dann fügen Sie steigende Konzentrationen von Phenylephrin.
Zum Beispiel 10 Nanomolar bis 100 Mikromolar. Dann, nach dem Waschen mit Standard-Krebs-Lösung, fügen Sie eine einzige Konzentration von Phenylephrin, bei etwa 70 Prozent der maximalen Kontraktion. Wenn die Kontraktion stabil ist, fügen Sie steigende Konzentrationen von Acetylcholin in Zwei-Minuten-Intervallen.
Zum Beispiel ein bis drei Nanomolar bis zehn bis dreißig Mikromolar, um Vasodilatation zu induzieren. Dieses Bild zeigt ein repräsentatives, ganzteiliges gescanntes Bild der menschlichen Albuminfärbung in einer Mausleber, die mit lipoprotein-mangelhaften iHeps mit geringer Dichte wiederbefüllt ist. Pfeile zeigen Cluster von menschlichen iHeps in die Mausleber eingepfropft.
Die Cluster von transplantierten menschlichen iHeps sind hier genauer zu sehen. Dieses Streudiagramm zeigt den Prozentsatz der neu bevölkerten menschlichen Albumin-positiven Zellen, die iHep-haltigen Bereichen in der Mausleber aus verschiedenen Spender-iPSCs entsprechen. Dies ist ein repräsentatives Bild der immunhistochemischen Färbung für menschliche Kerne in einer Mausleber, mit transplantierter familiärer Hypercholesterinämie iHeps.
Die Balkengrafik zeigt den Prozentsatz der neu bevölkerten menschlichen Kerne positive iHeps von verschiedenen Spender-iPSCs in LRG-Mauslebern. Dies sind repräsentative Bilder von menschlichem Albumin und menschlichen Kernen Färbung auf zwei aufeinander folgenden Abschnitten einer Mausleber, wieder bevölkert mit wilden Typ iHeps. Schließlich zeigt dieses Bild endothelabhängige Vasodilatation der Aorta bei familiärer Hypercholesterinämie menschlicher Leber-Chimermäuse, als Reaktion auf die erhöhungen Konzentrationen von Acetylcholin.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Leber-Chimermäuse mit menschlichen iPSC-abgeleiteten Hepatozyten erzeugt.
