Este método ha respondido a preguntas clave en el campo, como cómo generar un modelo de ratón quimérico hepático humano, hipercolesterolemia familiar. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar pruebas farmacológicas in vivo. Esta técnica tiene sindicación para los tratamientos de hipercolesterolemia familiar.
Como una nueva terapia para esta enfermedad, se puede probar utilizando tales modelos animales quiméricos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la hipercolesterolemia familiar, también se puede aplicar a otras enfermedades hepáticas hereditarias. 24 horas antes del injerto, descongelar 40 microlitros de matriz extracelular por ratón, colocando en una nevera, en una sala fría.
Enfríe una jeringa de insulina para cada ratón que se va a inyectar y una caja de 200 puntas de microlitrotro en un refrigerador Celsius de cuatro grados. Una hora antes del injerto, calentar la enzima de disociación celular, complementada con 50 microgramos por mililitro de DNAase 1, a temperatura ambiente y colocar RPMI 1640 medio, complementado con 20 por ciento de reemplazo sérico en hielo. Tome imágenes de contraste de fase de iHeps para registrar su estado, incluyendo morfología celular, crecimiento y densidad celular.
A continuación, lave cada poc de iHeps con 2 mililitros de calcio a temperatura ambiente y PBS sin iones de magnesio dos veces y luego agregue un mililitro de la enzima de disociación celular precalentada a cada pocólite. Devuelva las células a la incubadora durante ocho a diez minutos. Monitoree la morfología celular bajo el microscopio.
Cuando la mayoría de las células se vuelven redondas, agregue el mismo volumen de medio frío por pozo, pipetee las células suavemente para separarlas de la placa y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de 15 mililitros. Este paso es fundamental para la fiabilidad de los hepatocitos. Si las células son difíciles de separar de la placa, algunas se pueden dejar en la placa.
Y si las células se desprenden, luego pipetear suavemente después de la centrifugación, para obtener una suspensión de una sola célula. Repita el procedimiento de desprendimiento de celdas para cada pozo hasta que se recojan casi todas las celdas conectadas. Luego centrifugar a 200 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con dos mililitros de PBS frío en el tubo de quince mililitros. Pipetear las células suavemente para obtener una suspensión de una sola célula. Luego, pase las células a través de un colador celular de 40 micras para eliminar agregados.
Normalmente, uno a dos millones de células alrededor se pueden cosechar después de pocos-ter-ing. A continuación, agregue microlitros de 0.4 por ciento solución azul Trippan a 20 microlitros de suspensión celular. Cuente las células y registre la concentración de la suspensión celular como C.Calcular el volumen requerido de suspensión celular para inyectar un millón de células por ratón.
A continuación, asigne el volumen requerido de suspensión celular en tubos de 15 mililitros y centrífuga a 200 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 27,5 microlitros de PBS frío por ratón. Y luego añadir un volumen igual de matriz extracelular para un volumen final de 55 microlitros por ratón.
Ahora, coloque una de las jeringas de insulina fría en hielo. Desenchufe el pistón, transfiera 55 microlitros de suspensión celular a la jeringa y, a continuación, vuelva a colocar el pistón. Descargue las burbujas con cuidado y vuelva a colocar la jeringa en hielo.
Asegúrese de que los ratones LRG estén correctamente anestesiados antes de comenzar el procedimiento de inyección. Aplicar pomada veterinaria sobre los ojos para prevenir la sequedad durante el procedimiento de anestesia. Una vez que el ratón ha perdido el reflejo muscular a la estimulación, colóquelo en la posición derecha, lateral, decúbito.
Aplicar una gruesa capa de crema depilatoria en el área de incisión en el flanco izquierdo, y dejar durante cinco a ocho minutos. Retire la crema depilatoria y el cabello limpiando la zona con una almohadilla de gasa humedecida con agua. Frota el flanco izquierdo con 70 por ciento de etanol tres veces.
A continuación, localice el bazo, que se puede ver en el flanco izquierdo. Seguido de un remojo final con betadina para la desinfección. Después de usar tijeras para hacer una incisión de 0,5 a un centímetro en la piel y la pared abdominal, utilice fórceps para exteriorizar el bazo tirando suavemente del tejido adiposo circundante.
Estabilice suavemente el bazo con un hisopo. Inserte la aguja de la jeringa de insulina de tres a cuatro milímetros en el parénquima del bazo e inyecte suavemente aproximadamente 50 microlitros de suspensión celular. Retirar la aguja y colocar un hisopo de algodón sobre la inyección durante un minuto para evitar el sangrado y el derrame de material.
Devuelva el bazo al peritoneo y cierre la herida con suturas de nylon de cinco oh. Después de suturar, coloque el ratón en una jaula limpia con fácil acceso a alimentos y agua. Comience por extraer los órganos internos del ratón recién eutanasiado para que la aorta descendente, paralela a la columna vertebral, sea visible.
Luego disecciona el tejido adyacente y extrae el corazón. Utilice tijeras finas para diseccionar las aortas, colocando cada una en una solución Fría y oxigenada de Krebs. Después de la recolección, transfiera la solución de aortae en Krebs a un plato Petri recubierto de silicona.
Ancle el tejido conectivo para fijar la posición de la aorta sin estirarla. Bajo un microscopio estéril, utilice fórceps finos y tijeras de resorte para diseccionar la aorta libre de la grasa circundante y el tejido adventitial sin dañar la pared del vaso. A continuación, corte cada aorta en uno y medio a dos segmentos de longitud milimétrica.
A continuación, corta una pieza de dos centímetros de largo de alambre inoxidable de 40 micras de espesor e inserta suavemente en el lumen de la aorta. Sostenga el cable para transferir el segmento a la cámara de miograma de alambre, lleno de solución de Krebs oxigenada. Para medir la longitud de los segmentos de aortae al estudiar la contractilidad, coloque cada segmento perpendicularmente entre las mandíbulas y registre la lectura D1 en el micrómetro.
A continuación, retire el segmento y mueva las mandíbulas juntas. Registre la lectura D0 y calcule la longitud del segmento. A continuación, sujete el cable y fíjelo con el destornillador mientras coloca el segmento sin estirar entre las mandíbulas.
Para la normalización antes del experimento, establezca el miógrafo en cero en la posición sin estirar. Luego mueva lentamente las mandíbulas y observe el cambio de tensión de la aorta hasta llegar a los tres milantrotones. Después de 15 minutos, escurra la solución de la cámara de miograma y sustitúyala con una solución krebs fresca.
Después de esperar otros 15 minutos, ajuste de nuevo la tensión a tres mililitros. A continuación, cambie la solución estándar de Krebs a solución de Krebs complementada con cloruro de potasio de 60 milimolares, para inducir la contracción durante al menos quince minutos. Enjuagar con la solución fresca de Krebs tres veces, a continuación, añadir concentraciones crecientes de fenilefrina.
Por ejemplo, de 10 nanomolares a 100 micromolares. Luego, después de lavar con la solución estándar de Krebs, añadir una sola concentración de fenilefrina, en aproximadamente 70 por ciento de la contracción máxima. Cuando la contracción es estable, añadir concentraciones crecientes de acetilcolina en intervalos de dos minutos.
Por ejemplo, uno a tres nanomolares a diez a treinta micromolares para inducir vasodilatación. Esta imagen muestra una imagen escaneada representativa de la sección completa de la tinción de albúmina humana en un hígado de ratón repoblado con iHeps deficientes en receptores de lipoproteínas de baja densidad. Las flechas indican racimos de iHeps humanos injertados en el hígado del ratón.
Los grupos de iHeps humanos injertados se ven con más detalle aquí. Este gráfico de diagrama de dispersión muestra el porcentaje de células positivas de albúmina humana repobladas correspondientes a iHep que contienen áreas en el hígado del ratón, de diferentes iPSC de donantes. Esta es una imagen representativa de la tinción inmunohistoquímica para núcleos humanos en un hígado de ratón, con hipercolesterolemia familiar injertada iHeps.
El gráfico de barras muestra el porcentaje de núcleos humanos repoblados iHeps positivos de diferentes iPS De donantes en hígados de ratón LRG. Estas son imágenes representativas de la tinción de albúmina humana y núcleos humanos en dos secciones consecutivas de un hígado de ratón, repobladas con iHeps de tipo salvaje. Finalmente, esta imagen muestra vasodilatación dependiente del endotelio de la aorta en ratones quiméricos hepáticos humanos hipercolesterolemia familiar, en respuesta al aumento de las concentraciones de acetilcolina.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo generar ratones quiméricos hígado humano, utilizando hepatocitos humanos derivados de iPSC.
