이 방법은 인간 간 키메라 마우스 모델, 가족 성 콜레스테롤 혈증을 생성하는 방법과 같은 분야의 주요 질문에 답했습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 약물 검사를 수행할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 가족 성 콜레스테롤 혈증의 치료에 대 한 신디케이션이.
이 질병에 대 한 새로운 치료로, 그것은 같은 키 메 동물 모델을 사용 하 여 테스트 될 수 있습니다. 이 방법은 가족 성 콜레스테롤 혈 증에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하지만, 그것은 또한 다른 상속 된 간 질환에 적용 될 수 있습니다. 이식 하기 24 시간 전에, 얼음 상자에 배치 하 여 마우스 당 세포 외 매트릭스의 40 마이크로 리터를 해동, 차가운 방에.
각 마우스에 대한 인슐린 주사기를 식히고 4도 냉장고에 200 마이크로 리터 팁의 상자를 냉각. 이식 1시간 전에 DNAase 1의 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 보충된 세포 해리 효소를 따뜻하게 하고 실온으로 보충하고 RPMI 1640 배지를 얼음에 20% 세럼 교체로 보충합니다. iHeps의 위상 대비 이미지를 사용하여 세포 형태, 성장 및 세포 밀도를 포함한 상태를 기록하십시오.
다음으로, 실온 칼슘과 마그네슘 이온이없는 PBS2 밀리리터로 iHeps의 각 우물을 두 번 씻은 다음 미리 데운 세포 해리 효소의 1 밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 8-10분 간 반환합니다. 현미경의 밑에 세포 형태학을 감시합니다.
대부분의 세포가 둥글게 되면, 음당 동일한 양의 냉정한 체형에 추가하고, 세포를 부드럽게 피펫하여 플레이트에서 분리하고, 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 이 단계는 간세포 신뢰성에 매우 중요합니다. 세포가 접시에서 분리하기 어려운 경우, 일부는 접시에 남아있을 수 있습니다.
그리고 세포가 분리되면 원심분리 후 부드럽게 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 거의 모든 연결된 세포가 수집될 때까지 각 우물에 대한 세포 분리 절차를 반복합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3 분 동안 200g의 원심 분리기.
원심 분리 에 따라, 상체를 제거하고 15 밀리리터 튜브에서 차가운 PBS의 두 밀리리터로 세포를 다시 중단. 세포를 부드럽게 피펫하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 그런 다음 40 미크로넨 세포 여과기를 통해 세포를 전달하여 응집체를 제거합니다.
일반적으로, 약 1 ~2 백만 세포는 몇 ter-ing 후 수확 될 수 있습니다. 다음으로, 세포 현탁액의 20 마이크로 리터에 0.4 % Trypan 블루 용액의 마이크로 리터를 추가합니다. 세포를 계산하고 C.는 마우스 당 백만 세포를 주입하는 세포 현탁액의 필요한 볼륨을 계산으로 세포 현탁액의 농도를 기록합니다.
그런 다음 필요한 양의 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 3분 동안 200g에 15 밀리리터 튜브와 원심분리기에 할당합니다. 상체를 제거한 후 마우스당 27.5 마이크로리터의 감기 PBS에서 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 마우스 당 55 마이크로 리터의 최종 부피에 대해 셀룰러 매트릭스의 동일한 볼륨을 추가합니다.
지금, 얼음에 차가운 인슐린 주사기 중 하나를 배치합니다. 피스톤을 분리하고 셀 서스펜션 55마이크로리터를 주사기로 옮은 다음 피스톤을 다시 넣습니다. 거품을 조심스럽게 배출하고 주사기를 얼음에 다시 넣습니다.
주사 시술을 시작하기 전에 LRG 마우스가 제대로 마취되었는지 확인하십시오. 마취 시술 시 건조를 방지하기 위해 눈에 수의 연고를 바하십시오. 마우스가 자극에 근육 반사를 잃은 후, 오른쪽, 측면, decubitus 위치에 배치합니다.
왼쪽 측면의 절개 부위에 두꺼운 절제 크림층을 바르고 5~8분간 둡니다. 물에 촉촉한 거즈 패드로 부위를 닦아 서 탈모 크림과 머리카락을 제거합니다. 왼쪽 측면을 70%의 에탄올로 3번 문질러보시면 됩니다.
그런 다음 왼쪽 측면에서 볼 수있는 비장을 찾습니다. 그 다음에는 베타딘을 소독하는 마지막 몸을 담그고 있습니다. 가위를 사용하여 피부와 복벽에 0.5 내지 1센티미터 절개를 한 후, 집게를 사용하여 주변 지방 조직을 부드럽게 당겨 비장을 외부화하십시오.
면봉을 사용하여 비장을 부드럽게 안정시습니다. 인슐린 주사기의 바늘을 비장의 완두엽종에 3~4밀리미터 삽입하고 약 50마이크로리터의 세포 현탁액을 부드럽게 주입한다. 바늘을 철회하고 재료의 출혈과 유출을 방지하기 위해 1 분 동안 주입에 면봉을 놓습니다.
비장을 회고물로 돌려보내 5오 나일론 봉합사로 상처를 감는다. 봉합 후, 음식과 물에 쉽게 접근 할 수있는 깨끗한 케이지에 마우스를 배치합니다. 새로 안락사된 마우스에서 내부 장기를 제거하여 척추와 평행한 내림차순 대어타가 보이도록 한다.
그런 다음 인접한 조직을 해부하고 심장을 제거합니다. 미세 한 가위를 사용하여 대태를 해부하고 각 것을 차갑고 산소가 많은 크렙스 용액에 넣습니다. 수집 후, 크림스 용액의 아오르테를 실리콘 코팅 페트리 접시에 옮기.
결합 조직을 고정하여 대마 위치를 스트레칭하지 않고 고정합니다. 멸균 현미경하에서 미세한 집게와 스프링 가위를 사용하여 혈관 벽을 손상시키지 않고 주변 지방 및 모험 조직으로부터 대동맥을 해부하십시오. 그런 다음 각 대어타를 1mm 길이 세그먼트에서 반으로 자른다.
다음으로, 40 미크로닌 두꺼운 스테인리스 와이어의 2 센티미터 길이 조각을 잘라 부드럽게 대어타 루멘에 삽입. 와이어를 잡고 산소가 공급된 Krebs 용액으로 채워진 와이어 심모그래프 챔버로 세그먼트를 전송합니다. 수축을 연구할 때 대태 세그먼트의 길이를 측정하려면 각 세그먼트를 턱 사이에 수직으로 배치하고 마이크로미터에 D1 판독값을 기록합니다.
그런 다음 세그먼트를 제거하고 턱을 함께 이동합니다. D0 판독값을 기록하고 세그먼트의 길이를 계산합니다. 다음으로, 와이어를 고정하고 턱 사이에 뻗지 않은 세그먼트를 배치하는 동안 드라이버로 고정합니다.
실험 전에 정규화하려면 심근을 늘지 않은 위치에서 0으로 설정합니다. 그런 다음 턱을 천천히 떼어 내고 대마 긴장의 변화를 관찰하여 3 밀리뉴턴에 도달할 때까지 관찰합니다. 15분 후, 근소 챔버에서 용액을 빼내고 신선한 크렙스 용액으로 대체하십시오.
15분 더 기다린 후 다시 3밀리뉴턴으로 긴장을 조절합니다. 그런 다음 표준 크렙스 용액을 60 밀리몰러 염화칼륨으로 보충하여 최소 15분 동안 수축을 유도합니다. 신선한 크렙스 용액을 세 번 헹구고 페닐레프린의 농도를 증가시면 됩니다.
예를 들어, 10 나노 몰러에서 100 마이크로몰러. 그런 다음 표준 크렙스 용액으로 세척 한 후 최대 수축의 약 70 %에서 페닐레프린의 단일 농도를 추가하십시오. 수축이 안정되면 2 분 간격으로 아 세 틸 콜린의 농도 증가 추가.
예를 들어, 혈관 확장을 유도하기 위해 1-3 나노몰어에서 10~30마이크로몰어. 이 이미지는 저밀도 지단백 수용체 결핍 iHeps로 다시 채워진 마우스 간에서 인간 알부민 염색의 대표적인 전체 단면도 를 검사한 심상을 보여줍니다. 화살표는 마우스 간으로 이식 된 인간 iHeps의 클러스터를 나타냅니다.
이식된 인간 iHeps의 클러스터는 여기에서 더 자세히 볼 수 있습니다. 이 산란표 그래프는 다른 기증자 iPSC로부터 마우스 간내 영역을 포함하는 iHep에 대응하는 재채워진 인간 알부민 양성 세포의 백분율을 보여줍니다. 이것은 마우스 간에서 인간 핵에 대한 면역 히스토케미칼 염색의 대표적인 이미지이며, 이식된 가족 성 콜레스테롤혈증 iHeps.
바 그래프는 LRG 마우스 간에서 다른 기증자 iPSCs에서 다시 채워진 인간 핵 양성 iHeps의 백분율을 보여줍니다. 이들은 야생 형 iHeps로 다시 채워진 마우스 간의 2개의 연속단에 염색하는 인간 알부민 및 인간 핵의 대표적인 심상입니다. 마지막으로, 이 이미지는 아세틸콜린의 농도 증가에 대응하여 가족 성 콜레스테롤혈증 인간 간 키메라 마우스에서 대동맥의 내피성 혈관 확장법을 보여줍니다.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 인간 iPSC 파생 간 세포를 사용하여 인간 간 키메라 마우스를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
