诱导多潜能干细胞源性肝细胞的家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型

该方法回答了该领域的关键问题，如如何生成人类肝脏嵌合小鼠模型、家族性高胆固醇血症。这种技术的主要优点是，它允许在体内进行药物测试。该技术对家族性高胆固醇血症的治疗具有联合性。

作为治疗这种疾病的新疗法，可以使用这种嵌合动物模型进行测试。虽然这种方法可以提供对家族性高胆固醇血症的洞察，但它也可以应用于其他遗传性肝脏疾病。在放飞前24小时，将每只小鼠的40微升细胞外基质解冻，放在冰盒中，放在冰冷的房间里。

在四摄氏度的冰箱中冷却每只小鼠的胰岛素注射器和一盒 200 微升提示。在移植前一小时，将细胞分离酶加热，每毫升DNAase 1补充50微克，以室温和放置RPMI 1640培养基，在冰上补充20%的血清替代。拍摄 iHeps 的相位对比度图像以记录其状态，包括细胞形态、生长和细胞密度。

接下来，用2毫升室温钙和镁无离子PBS洗涤每井，然后向每个井中加入1毫升预热细胞分离酶。将细胞返回孵化器8至10分钟。在显微镜下监测细胞形态。

当大多数细胞变成圆形时，每井加入等量的冷介质，轻轻移液细胞从板中分离，并将细胞悬浮液转移到新的15毫升管中。此步骤对于肝细胞的可靠性至关重要。如果电池难以从板中分离，则一些电池可以留在板上。

如果细胞分离，然后移液器在离心后轻轻，获得单细胞悬浮。对每一个井重复细胞分离过程，直到收集几乎所有附着的细胞。然后在200克的离心机在4摄氏度下3分钟。

离心后，取出上清液，并在十五毫升管内用两毫升冷PBS重新悬浮细胞。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。然后，通过40微米细胞过滤器传递细胞以去除聚集体。

通常，大约一到两百万个细胞可以在几分之一的细胞后收获。接下来，在20微升的细胞悬浮液中加入0.4%的锥盘蓝色溶液。计算细胞数，将细胞悬浮液的浓度记录为C.计算所需的细胞悬浮量，每只小鼠注射一百万个细胞。

然后将所需的细胞悬浮量分配到15毫升管中，并在200克下离心，在4摄氏度下3分钟。取出上清液后，将细胞重新悬浮在每只鼠标27.5微升的冷PBS中。然后为每只鼠标 55 微升的最终体积添加相等的细胞外矩阵。

现在，把一个冷胰岛素注射器放在冰上。拔下活塞的插头，将 55 微升的细胞悬浮液转移到注射器中，然后将活塞放回。小心释放气泡，将注射器放回冰上。

在开始注射程序之前，确保 LRG 小鼠正确麻醉。在麻醉过程中，在眼睛上涂抹兽医软膏，防止干燥。一旦鼠标失去了肌肉反射刺激，把它放在右，横向，脱光的位置。

在左侧的切口区域涂抹一层厚厚的脱毛霜，然后离开五到八分钟。用水润湿纱布垫擦拭区域，去除脱毛霜和头发。用 70% 乙醇三次擦洗左侧侧翼。

然后找到脾脏，这可以在左侧侧翼看到。然后最后浸泡与贝塔丁消毒。使用剪刀在皮肤和腹部壁上做0.5至1厘米切口后，使用钳子轻轻拉扯周围的脂肪组织，使脾脏外化。

使用拭子轻轻稳定脾脏。将胰岛素注射器的针头插入脾脏的针中，轻轻注射约50微升细胞悬浮液。缩回针头，在注射液上放置棉签一分钟，以防止出血和物质溢出。

将脾脏返回到脾脏，用五欧尼龙缝合线关闭伤口。苏特后，将鼠标放在一个干净的笼子里，方便地获得食物和水。首先从刚安乐死小鼠中去除内脏，使与脊柱平行的降下大母骨可见。

然后解剖相邻的组织，取出心脏。使用细剪刀解剖青液，将每个溶液放入冷氧的 Krebs 溶液中。收集后，将 Krebs 溶液中的 aortae 转移到硅胶涂层的培养皿中。

固定结缔组织以固定大音库位置，无需拉伸。在无菌显微镜下，使用细钳和弹簧剪刀解剖从周围脂肪和结节组织中释放的动脉，而不会损坏血管壁。然后将每个大项切成一个半到两毫米长的段。

接下来，切一块两厘米长的40微米厚的不锈钢丝，轻轻插入大母流明。握住导线，将导线转移到充满氧的 Krebs 溶液的导线刻版室。要测量在研究收缩时，Aortae 段的长度，请将每个段垂直放在下颚之间，并在微米上记录 D1 读数。

然后拆下段并一起移动钳口。记录 D0 读数并计算段的长度。接下来，夹紧导线，用螺丝刀固定，同时将未拉伸的段放在钳口之间。

在实验前进行规范化，请将 myograph 在未拉伸位置的 myograph 设置为零。然后慢慢将下颚分开，观察大项张力的变化，直到达到三毫纽顿。15 分钟后，将溶液从记忆室排出，然后更换为新鲜的 Krebs 溶液。

再等15分钟后，再次将张力调整为3毫纽顿。然后将标准 Krebs 溶液更改为 Krebs 溶液，辅以 60 毫摩尔氯化钾，使收缩至少 15 分钟。用新鲜的 Krebs 溶液冲洗三次，然后加入日益浓度增加的苯肾上腺素。

例如，10 纳米摩尔到 100 微摩尔。然后，用标准的 Krebs 溶液洗涤后，加入一个浓度的苯肾上腺素，大约 70% 的最大收缩。当收缩稳定时，每隔两分钟加入乙酰胆碱浓度增加。

例如，一到三纳米摩尔到十到三十微摩尔诱导血管扩张。此图显示了一个代表性的整节扫描图像，即用低密度脂蛋白受体缺乏 iHeps 重新填充的小鼠肝脏中人类白蛋白染色的具有代表性的整节扫描图像。箭头表示进入小鼠肝脏的人类 iHeps 集群。

这里更详细地看到被包裹的人类 iHeps 的集群。此散点图显示了与小鼠肝脏中包含区域相对应的重新填充的人类白化素阳性细胞的百分比，这些区域来自不同的供体 iPSCs。这是小鼠肝脏中人类核的免疫石化学染色的代表性图像，具有家族性高胆固醇血症。

条形图显示了LRG小鼠肝脏中不同供体iPSCs的重新填充人类核阳性iHeps的百分比。这些是人类白化素和人类核染色在小鼠肝脏的两个连续部分的代表性图像，重新填充野生型iHeps。最后，此图显示了家族性高胆固醇血症人类肝嵌合小鼠中大干的内皮依赖性血管扩张，以应对乙酰胆碱浓度的增加。

看完这段视频后，你应该对如何使用人类 iPSC 衍生的肝细胞生成人类肝脏嵌合小鼠有一个很好的理解。