Cette méthode a répondu à des questions clés sur le terrain, telles que la façon de générer un modèle de souris chimérique du foie humain, hypercholestérolémie familiale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer des tests de dépistage de drogues in vivo. Cette technique a une syndication pour les traitements de l’hypercholestérolémie familiale.
Comme nouvelle thérapie pour cette maladie, il peut être testé à l’aide de tels modèles animaux chimériques. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’hypercholestérolémie familiale, elle peut également être appliquée à d’autres maladies hépatiques héréditaires. 24 heures avant l’engraftment, décongeler 40 microlitres de matrice extracellulaire par souris, en plaçant dans une glacière, dans une pièce froide.
Réfrigérer une seringue à insuline pour chaque souris à injecter et une boîte de 200 conseils de microlitres dans un réfrigérateur de quatre degrés Celsius. Une heure avant l’engraftment, réchauffer l’enzyme de dissociation cellulaire, complétée par 50 microgrammes par millilitre de DNAase 1, à température ambiante et placer RPMI 1640 moyen, complété par 20 pour cent de remplacement sérique sur la glace. Prenez des images de contraste de phase d’iHeps pour enregistrer leur statut, y compris la morphologie cellulaire, la croissance et la densité cellulaire.
Ensuite, lavez chaque puits d’iHeps avec 2 millilitres de calcium à température ambiante et de magnésium sans ion PBS deux fois, puis ajoutez un millilitre de l’enzyme de dissociation cellulaire préchauffée à chaque puits. Remettre les cellules dans l’incubateur pendant huit à dix minutes. Surveillez la morphologie cellulaire au microscope.
Lorsque la plupart des cellules deviennent rondes, ajouter un volume égal de milieu froid par puits, pipette les cellules doucement pour se détacher de la plaque, et transférer la suspension cellulaire à un nouveau tube de 15 millilitres. Cette étape est essentielle pour la fiabilité des hépatocytes. Si les cellules sont difficiles à détacher de la plaque, certaines peuvent être laissées sur la plaque.
Et si les cellules se détachent, puis pipette doucement après centrifugation, pour obtenir une suspension à cellule unique. Répétez la procédure de détachement cellulaire pour chaque puits jusqu’à ce que presque toutes les cellules attachées soient collectées. Puis centrifugeuse à 200 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.
Après centrifugation, retirer le supernatant et suspendre à nouveau les cellules avec deux millilitres de PBS froid dans le tube de quinze millilitres. Pipette les cellules doucement pour obtenir une suspension à cellule unique. Ensuite, passez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 microns pour enlever les agrégats.
Normalement, un à deux millions de cellules environ peuvent être récoltées après quelques ter-ing. Ensuite, ajoutez des microlitres de 0,4 pour cent trypan solution bleue à 20 microlitres de suspension cellulaire. Comptez les cellules et enregistrez la concentration de suspension cellulaire comme C.Calculer le volume requis de suspension cellulaire pour injecter un million de cellules par souris.
Ensuite, allouer le volume requis de suspension cellulaire en tubes de 15 millilitres et centrifugeuse à 200 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir enlevé le supernatant, suspendre à nouveau les cellules dans 27,5 microlitres de PBS froid par souris. Et puis ajouter un volume égal de matrice extracellulaire pour un volume final de 55 microlitres par souris.
Maintenant, placez l’une des seringues à insuline froides sur la glace. Débrancher le piston, transférer 55 microlitres de suspension cellulaire dans la seringue, puis remettre le piston. Déchargez soigneusement les bulles et remetz la seringue sur la glace.
Assurez-vous que les souris LRG sont correctement anesthésiées avant de commencer la procédure d’injection. Appliquez de l’onguent vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure d’anesthésie. Une fois que la souris a perdu le réflexe musculaire à la stimulation, placez-la dans la position droite, latérale, decubitus.
Appliquer une épaisse couche de crème depilatory sur la zone d’incision dans le flanc gauche, et laisser pendant cinq à huit minutes. Retirer la crème depilatory et les cheveux en essuyant la zone avec un tampon de gaze humidifié à l’eau. Frottez le flanc gauche avec 70 pour cent d’éthanol trois fois.
Ensuite, localisez la rate, qui peut être vu dans le flanc gauche. Suivi d’un trempage final avec de la bétadine pour la désinfection. Après avoir utilisé des ciseaux pour faire une incision de 0,5 à un centimètre dans la peau et la paroi abdominale, utilisez des forceps pour extérioriser la rate en tirant doucement le tissu adipeux environnant.
Stabiliser délicatement la rate à l’aide d’un écouvillon. Insérez l’aiguille de la seringue à insuline de trois à quatre millimètres dans le parenchyme de la rate et injectez doucement environ 50 microlitres de suspension cellulaire. Rétractez l’aiguille et placez un coton-tige sur l’injection pendant une minute pour éviter les saignements et les déversements de matériel.
Remettre la rate au péritoine et fermer la plaie avec des sutures en nylon de cinq oh. Après suturing, placez la souris dans une cage propre avec un accès facile à la nourriture et à l’eau. Commencez par enlever les organes internes de la souris fraîchement euthanasiée afin que l’aorte descendante, parallèle à la colonne vertébrale, soit visible.
Puis disséquer le tissu adjacent, et enlever le cœur. Utilisez des ciseaux fins pour disséquer les aortes, en plaçant chacune dans la solution krebs froide et oxygénée. Après la collecte, transférer l’aorte dans la solution Krebs dans une boîte de Pétri recouverte de silicone.
Épinglez le tissu conjonctif pour fixer la position de l’aorte sans l’étirer. Sous un microscope stérile, utilisez des forceps fins et des ciseaux à ressort pour disséquer l’aorte libre de la graisse environnante et du tissu adventitial sans endommager la paroi du vaisseau. Ensuite, coupez chaque aorte en segments d’une longueur d’un millimètre et demi à deux millimètres.
Ensuite, coupez un morceau de deux centimètres de long de 40 microns de fil inoxydable épais, et insérez doucement dans le lumen aorta. Maintenez le fil pour transférer le segment à la chambre myographique de fil, remplie de solution oxygénée de Krebs. Pour mesurer la longueur des segments d’aorte lors de l’étude de la contractilité, placez chaque segment perpendiculairement entre les mâchoires et enregistrez la lecture D1 sur le micromètre.
Retirez ensuite le segment et déplacez les mâchoires ensemble. Enregistrez la lecture D0 et calculez la longueur du segment. Ensuite, serrez le fil et fixez-le avec le tournevis tout en plaçant le segment tendu entre les mâchoires.
Pour la normalisation avant l’expérience, réglez le myographe à zéro dans la position tendue. Puis déplacez lentement les mâchoires à part et observez le changement de tension de l’aorte jusqu’à atteindre trois millinewton. Après 15 minutes, égoutter la solution de la chambre myographique et la remplacer par une solution Krebs fraîche.
Après avoir attendu encore 15 minutes, réglez à nouveau la tension à trois millinewton. Ensuite, changer la solution Krebs standard à la solution Krebs complétée par du chlorure de potassium de 60 millimlaires, pour induire une contraction pendant au moins quinze minutes. Rincer avec la solution Krebs fraîche trois fois, puis ajouter des concentrations croissantes de phényléphrine.
Par exemple, 10 nanomolaire à 100 micromolaires. Puis, après le lavage avec la solution krebs standard, ajouter une seule concentration de phényléphrine, à environ 70 pour cent de la contraction maximale. Lorsque la contraction est stable, ajouter des concentrations croissantes d’acétylcholine à intervalles de deux minutes.
Par exemple, un à trois nanomolaire à dix à trente micromolaires pour induire la vasodilatation. Cette image montre une image numérisée représentative de la section entière de la coloration humaine d’albumine dans un foie de souris repeuplé avec des iHeps récepteur-déficients de lipoprotéine de basse densité. Les flèches indiquent des grappes d’iHeps humains greffés dans le foie de souris.
Les grappes d’iHeps humains greffés sont vus plus en détail ici. Ce graphique scatterplot montre le pourcentage de cellules positives de l’albumine humaine repeuplées correspondant à l’iHep contenant des zones dans le foie de souris, provenant de différents iPSCs donneurs. Il s’agit d’une image représentative de la coloration immunohistochimique pour les noyaux humains dans un foie de souris, avec l’hypercholestérolémie familiale greffée iHeps.
Le graphique à barres montre le pourcentage d’iHeps humains repeuplés d’iHeps positifs provenant de différents iPSC donneurs dans les foies de souris LRG. Ce sont des images représentatives de l’albumine humaine et des noyaux humains souillant sur deux sections consécutives d’un foie de souris, repeuplées avec des iHeps de type sauvage. Enfin, cette image montre la vasodilatation endothélium-dépendante de l’aorte dans les souris chimériques humaines familiales d’hypercholestérolémie de foie, en réponse aux concentrations croissantes de l’acétylcholine.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des souris chimériques du foie humain, en utilisant des hépatocytes humains dérivés de l’iPSC.
