Name: a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish
Uploaded: 2018-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise von einem Wissenschaftler Development Grant von der American Heart Association unterstützt (14SDG18160021, YD), die USA NIH R01 gewährt HL 81753 und HL 107304 XX und der Mayo Foundation bis XX.

Alle hier beschriebene Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press 2011) durchgeführt, und sie wurden durch die Mayo Klinik institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Erwachsene Zebrafisch-Vorbereitung
<ol><li>Richten Sie ausreichend Brutpaare im Panzer überqueren mindestens doppelt so viele wie die totale Fische für DOX Injektion benötigt zu erwerben. Wenn Fisch mit verschiedene genetische Hintergründe zu vergleichen, züchten Sie alle Fische innerhalb der gleichen Woche für Alter abgestimmten Kontrollen sorgen.</li>
	<li>Sammle Fischembryonen am nächsten Morgen auf 100 mm Petrischalen übertragen, und in einem Inkubator 28,5 ° C aufbewahren. Halten Sie Embryonen bei einer geringen Dichte (< 100 Embryonen/Petrischale).</li>
	<li>Aktualisieren der Embryo Wasser täglich Sex Ungleichgewicht zu vermeiden, und manuell entfernen Tote Eier rechtzeitig mit einer transferpipette.</li>
	<li>Legen Sie die gleiche Anzahl von Embryonen in jedem Tank (z. B. 60 Embryonen/3 L Medium tank zunächst) für Dichte abgestimmten Kontrollen sorgen.</li>
	<li>Starten Sie Pantoffeltierchen Fütterung auf 4 Tage nach Befruchtung (Dpf).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Fische täglich in der juvenilen Phase. Passen Sie die Anzahl der Fische um ähnliche Fische sicherzustellen Dichte.</li>
	<li>Wenn Fisch 4 Wochen des Alters erreichen, transfer bis zu 20 Fische in jeder neuen 3 L mittlerer Panzer für weiteres Wachstum. Start mit live geschlüpften Artemia verfüttern.</li>
</ol>2. Herstellung und Aufbewahrung von DOX-Stammlösung
Hinweis: DOX kann aus verschiedenen Bio-Unternehmen erworben werden. Die Verbindung ist in der Regel als Pulver in dunkel braun Container erworben.
<ol><li>Lösen Sie gründlich das DOX-Pulver in deionisiertes Wasser um sicherzustellen, dass keine Klumpen mit einer Endkonzentration von 5 mg/mL als Vorratslösung sichtbar sind auf. Aliquoten 1 mL der DOX Lager in jeder 1,5 mL-Safe-Lock-Rohr. Wickeln Sie die 1,5 mL Röhrchen mit Aluminium-Folie-Papier, das DOX vor Lichteinfall zu schützen. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Kapuze.</li>
	<li>Halten Sie die DOX-Stammlösung bei 4 ° C für die Lagerung. Für die langfristige Lagerung (> 4 Wochen) von DOX-Stammlösung, führen die optionalen Abschnitt 3 beschrieben.</li>
</ol>3. Qualitätskontrolle von DOX mit Zebrafish Embryos (Optional)
Hinweis: DOX ist sowohl Feuchtigkeit und lichtempfindlich, so dass es die Wirksamkeit von Medikamenten für die Modellierung von DIC nach längerer Lagerung verlieren kann. Für DOX von verschiedenen Unternehmen oder auch verschiedener Chargen von der gleichen Firma gekauft ist es sinnvoll, die Wirksamkeit von Medikamenten mit Wildtyp (WT) Zebrafisch-Embryonen vor der Durchführung der Experimente an ausgewachsenen Fischen zu kalibrieren. Diese Methode stammt aus einer gemeldeten Zebrafish embryonale DIC Modell21.
<ol><li>Sammeln Sie WT Zebrafisch-Embryonen aus mindestens 2 Paare von Fisch. Dechorionate Embryonen im 24 h nach Befruchtung (hpf) manuell mithilfe einer Spritze mit einer Mikro-Nadel. Alternativ behandeln Sie den Embryo mit Proteinase K bei Endkonzentration von 10 µg/mL für 10-15 min in einem 30 ° C Brutschrank. Aktualisieren Sie das Embryo Wasser nach Dechorionation. Entfernen von Toten Embryonen und halten mindestens 36 Embryonen von jeder Charge.</li>
	<li>Verdünnen Sie die DOX-Stammlösung in frischen Embryonen Wasser, eine Endkonzentration von 100 µM. Das Volumen der Lösung ist 100 µL für jeden 3 Embryonen. Mischen Sie die verdünnte Lösung der DOX durch Wirbel. Die endgültige verdünnte Lösung sollte eine leichte, rote Farbe.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL/Well des verdünnten DOX-Lösung von einem sauberen 96-Well-Sichtscheibe.</li>
	<li>Nehmen Sie 3 Dechorionated Embryonen mit einer Kunststoff transferpipette und halten Sie die Embryonen kurz vor dem Ende der Pipettenspitze. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in jede Vertiefung mit DOX Lösung. Lassen Sie das Ende der Spitze berühren die Lösung und die Embryonen in den Brunnen schwimmen lassen. Hinweis: Vermeiden Sie manuell drücken die Embryonen, die füllen Sie Wasser in den Brunnen und die DOX Lösung verdünnen.</li>
	<li>Aktualisieren Sie die DOX-Lösung bei 48 hpf. Zu diesem Zeitpunkt beobachten Sie die Brunnen unter einem Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung, Toten Embryonen (Einstellung der Herzschlag) oder Embryonen mit Ödem zu identifizieren. Zählen Sie und entfernen Sie alle Toten Embryonen sowie rechtzeitig, sonst schnell die restlichen Embryonen ausgesetzt, die Lösung mit Toten Embryonen sterben können.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Embryonen bei 72 hpf und sie zählen. Die DOX-Behandlung gilt als "gutes Medikament Wirksamkeit" Wenn > 25 % Tod (Einstellung der Herzschlag) in den beiden Reihen von Embryonen beobachtet werden.</li>
</ol>4. Voreinspritzung Vorbereitung
Hinweis: Fisch von 8 Wochen bis 6 Monate alt sind für die DOX Injektion verwendet. Körpergewicht (BWs) eines gereiften wilden indischen Karyotyp (WIK) Fisches injiziert werden, reichen von 0,2-0,5 g.
<ol><li>Schnell die Fische für 24 h vor der Injektion.</li>
	<li>Den Fisch mit Embryo wasserhaltigen 0,16 mg/mL Tricaine zu betäuben. Verwenden Sie ein sauberes Filterpapier trocknen das Wasser von beiden Seiten des Körpers. Das BW jeden Fisch auf einer Skala zu messen. Gruppieren Sie Fisch innerhalb 10 % Unterschied im BW zur späteren Injektion. Hinweis: Um die Arbeitsbelastung bei diesem Schritt zu minimieren, gelten Fische innerhalb von 10 % Unterschied im BW die gleiche Größe; Daher bereiten Sie eine DOX funktionierende Lösung entsprechend ihren Mittelwert BW.</li>
	<li>Plan, jeder Erwachsene Fisch mit 5 µL Lösung zu injizieren. Berechnen Sie die DOX Arbeit Konzentration nach dem Fisch Zahlen und BWs. Hinweis: Um chronische Kardiotoxizität bis zu 6 Monaten zu untersuchen, verwenden Sie DOX bei einer Dosis von 20 mg/kg. Um akute Kardiotoxizität von DOX zu studieren, kann bis zu 50 mg/kg BW die DOX-Dosis erhöht werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie die DOX-Lager in 1 x Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS) für die entsprechenden Arbeiten Konzentrationen. Wirbel um die Lösung zu mischen. Kurz spin-down, um die Lösung zu sammeln.</li>
</ol>(5) DOX Injektion bei ausgewachsenen Fischen
<ol><li>Ort eine saubere 100 mm Petrischale mit einem Schwamm in seinem Inneren, unter dem Mikroskop Dissektion, dann stellen Sie den Fokus. Schneiden Sie den Schwamm einen Hohlraum von ca. 4 cm in der Länge um einen Fisch zu halten machen. Machen Sie einen längeren Hohlraum für eine größere Fische.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 34 G-Nadel mit einer 10 µL Mikro-Spritze. Spülen Sie die Nadel mit 1 X HBSS Puffer um Luftblasen und Blöcke aus der Spritze und Schläuche zu entfernen.</li>
	<li>Die Erwachsenen Fische im Embryo wasserhaltigen 0,16 mg/mL Tricaine 2 min. lang zu betäuben. Hinweis: Längere Anesthetization über 5 min gefolgt von DOX Injektion kann leicht dazu führen Fische Tod.</li>
	<li>Weichen Sie den Schwamm im Embryo Wasser mit Tricaine und übertragen Sie die Fische auf den Schwamm für die Injektion.</li>
	<li>
Durchführen Sie IP DOX Injektion durch eine der beiden Methoden, die unten beschrieben.
	<ol>
<li>Klassische IP-Injektion29<ol>
<li>Positionieren Sie den Fisch mit dem Bauch bis in den Hohlraum des Schwammes. Schnell setzen Sie die Nadel mit einem 45° Winkel auf den Körper des Fisches in der Mittellinie zwischen den Bauchflossen und dringen ca. 1-2 mm. alle DOX Lösung langsam loslassen. Warten Sie 5 s vor dem Herausziehen der Nadelöhrs. Überprüfen Sie die DOX-Lieferung durch eine sichtbare rote Farbe in den Bauch des Fisches.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alternative IP-Injektion<ol>
<li>Legen Sie den Fisch seitlich auf den Schwamm mit der vorderen auf der rechten Seite. Vorsichtig die Fische mit einem stumpfen Ende Zangen mit der linken Hand zu stabilisieren und die Mikro-Spritze mit der rechten Hand halten.</li>
			<li>Positionieren Sie die Nadel unter die Seitenlinie oberhalb der Beckenflosse mit der schräge nach oben. Stechen Sie auf 07:00-Position in einem 45 °-Winkel zeigen die Nadel ca. 3-4 mm zum Fisch Hohlraum befindet sich zwischen den Becken und die analen Flossen, und dann drücken Sie langsam den Kolben. Überprüfen Sie die DOX-Lieferung durch eine sichtbare rote Farbe in den Bauch des Fisches.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie schnell die injizierten Fische auf einen sauberen Übergang Tank mit frischen System Wasser um die Fische wieder zu ermöglichen. Spülen Sie die Nadel einmal mit 1 X HBSS Puffer zwischen den Injektionen.</li>
</ol>6. nach der Injektion Fisch Management
<ol><li>Nach der Injektion zurück die Fische auf das System mit fließendem Verkehr. Wenn möglich, halten Sie DOX-behandelten Fische separat vom Hauptsystem Cross-Kontamination unter verschiedenen Panzern zu vermeiden, die die Zirkulation zu teilen.</li>
	<li>Die injizierten Fische schnell für ein weiteres 24 h für die Wiederherstellung. Beobachten Sie die Fische während der ersten Woche täglich. Entfernen Sie die Toten Fische rechtzeitig um Infektion zu den anderen Fischen zu vermeiden. Hinweis: Fisch Todesfälle innerhalb der ersten 24 h sind wahrscheinlich durch körperliche Verletzungen, die durch die Injektion.</li>
	<li>Weitere pflegen Sie die DOX-gestresste Fische für längs-Beobachtungen. Entfernen Sie tote Fische in Zeit, Infektionen, andere Fische in den Tank zu vermeiden. Hinweis: Fisch-Nummern sind dokumentiert, um ein Überleben Kurve zu erzeugen.</li>
	<li>Verwenden Sie verschiedene experimentelle Tests zum Phänotyp der DOX-gestresste Fische wie Echokardiographie30, Herzfunktion Reporter transgene Linie23, Schwimmen Herausforderung26und Quantifizierung von anderen pathologischen Umbau Markierungen am23.</li>
</ol>

<ol>
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D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-dependent+pathways+suppress+myocardial+cell+hypertrophy.">Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).</li><li>Hershman, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+cardiac+risk+factors,+and+cardiac+toxicity+in+elderly+patients+with+diffuse+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.">Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).</li><li>Silber, J. H., Barber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+doxorubicin-induced+congestive+heart+failure.">Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.</a> Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), (2009).</li><li>Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protocol+for+the+oral+administration+of+test+chemicals+to+adult+zebrafish.">A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish.</a> Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+adult+zebrafish.">Gavaging adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Um eine progressive DIC zu modellieren, wurde die Dosis von 20 mg/kg DOX experimentell als die höchste Dosis ermittelt, die keine signifikante Fisch Tod während 1 Wpi, aber immer noch die Ergebnisse im Fisch Tod und die Verringerung der Herzfunktion nach 4 Wpi (Abbildung 3 und verursacht Abbildung 4). Diese Dosis ist vergleichbar mit denen häufig in Nager DIC-Modelle (15-25 mg/kg) und der Grenze kumulative Dosis beim Menschen (550 mg/m2, das entspr...

Doxorubicin (DOX), auch benannt Adriamycin, wurde als "Anti-neoplastische Drug" seit den 1960er Jahren1,2entwickelt. Es ist jetzt noch aktiv als eine wichtige Chemotherapeutikum für ein breites Spektrum von Tumoren eingesetzt. Doch klinische Anwendung der DOX wurde erschwert durch die dosisabhängige Toxizität, insbesondere Kardiotoxizität zeichnet sich durch Variable Symptome von asymptomatischen elektrokardiographischen Veränderungen bis hin zu Perikarditis und dekompensierter Kardiomyopathie 1 , 2. bisher mindestens drei wichtige Hypothesen um zu erklären, DIC, einschließlich aktivierter reaktive Sauerstoff Spezies (ROS)1,3,4,5, Hemmung der Topoisomerase II-β (angehoben worden TOP2β)6,7und Modulation von intrazellulären Calcium release1,8,9. Beweise sammeln, schlägt auch genetischen Veranlagung als entscheidender Risikofaktor für DIC10,11,12,13. Bleiben Sie gen Identitäten im Zusammenhang mit diesen DIC Prädispositionen, jedoch weitgehend unbekannt. Dexrazoxan ist der einzige adjuvante Agent genehmigt durch die US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von DIC, aber mit begrenzten Umsetzung14,15,16, unterstreicht die Notwendigkeit, zusätzliche identifizieren therapeutische Strategien. Tiermodelle der DIC sind daher für diese Zwecke erforscht. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit und Einfachheit, mechanistische Studien auf DIC Modelle könnte haben breitere Auswirkungen auf andere Arten von Kardiomyopathien: gemeinsame Pathogenese kann gemeinsam genutzt werden Kardiomyopathien der verschiedenen Ätiologien, vor allem bei später pathologischen Stadien17,18,19,20.
Neben der Nager-Modelle von DIC entwickelten Zebrafisch DIC Modelle mit höheren Durchsatz um die Entdeckung der neuen genetischen Faktoren und Therapeutika zu erleichtern. Eine embryonale DIC-Modell wurde in den transparenten Zebrafish Embryos für das screening von therapeutischen Substanzen21eingerichtet. Angesichts der Tatsache, dass der Kardiomyopathien Altersdiabetes Krankheiten mit einer progressiven Pathogenese, entwickelt Erwachsenen Zebrafisch Kardiomyopathie Modelle wurden22,23,24,25,26. Wir erzeugt das erste erworbene Modell für Kardiomyopathie infolge chronischer Anämie24, gefolgt von DIC als das zweite Modell der erworbenen Kardiomyopathie in Erwachsenen Zebrafisch23. Wir fanden, dass die Injektion eines einzigen Bolus von DOX in Erwachsenen Zebrafisch Kardiotoxizität induziert, die aus einer akuten Phase etwa innerhalb 1 Woche nach der Injektion (Wpi), gefolgt von einer chronischen Phase der Kardiomyopathie bis zu 6 Monate nach der Injektion besteht. Während Haploinsufficiency des mechanistischen Ziel von Rapamycin(Mtor) bessert Kardiomyopathie in der chronischen Phase, übertreibt es Fischsterblichkeit in der Akutphase unterstreicht den Wert der Erwachsenen DIC-Modells, Bühne-abhängige zu erkennen Mechanismen23. Wir zeigten weiter, dass die Erwachsenen DIC-Modell verwendet werden kann, auf eine Sammlung von Zebrafisch insertional kardiale (ZIC) Mutanten hinweisen, die über ein Transposon-basierte insertional Mutagenese Ansatz27generiert werden. Ein pilot Bildschirm identifiziert 3 bekannten Kardiomyopathie Gene sowie DnaJ (hps40) Homolog, Unterfamilie B und Mitglied 6 b (dnajb6b) als neue DIC Anfälligkeit Gene28. Daher führte die Generation der Erwachsenen DIC-Modells im Zebrafisch, eine neue Methodik, die systematisch ermöglicht die Identifizierung der genetischen Modifikatoren für DIC, ergänzt die bestehenden genomweite Studie (GWAS) und quantitative Trait Locus (QTL ) Analyse.
Während der Generierung und Implementierung des Erwachsenen Zebrafisch-DIC-Modells haben wir erhebliche Abweichungen zwischen den verschiedenen Wissenschaftlern und/oder auch unter den verschiedenen Injektionen durchgeführt durch den gleichen Prüfer festgestellt. Die longitudinale Natur des Modells erlegt Herausforderungen für Registrierung Ergebnisse von verschiedenen Forschern und der sequentiellen Problembehandlungsprozess. Um die Verwendung dieser einfachen Kardiomyopathie-induzierende Stress-Methode durch die Forschungsgemeinschaft zu erleichtern, wir beschreiben unser Protokoll detailliert vorliegenden zwei Arten von IP-Injektion und Überlegungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Forschern zu diskutieren.

<table><tbody><tr><td>Crossing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Fish breeding</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Maintaining embryo</td></tr><tr><td>3 L medium tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZT280</td><td>Maintaining fish</td></tr><tr><td>Paramecia</td><td>Carolina</td><td>131560</td><td>Food for juvenile fish</td></tr><tr><td>Live hatched brine shrimp</td><td>in house</td><td></td><td>Food for adult fish</td></tr><tr><td>Doxorubicin hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tube</td><td>Eppendorf</td><td>No. 022363204</td><td>For drug storage</td></tr><tr><td>Aluminum foil paper</td><td>Fisher</td><td>1213104</td><td>For preventing light exposure</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>No. 03115887001</td><td>For dechorionating embryo</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025076</td><td>Vehicle for DOX</td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Falcon</td><td>431741</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L NanoFil micro-syringe</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>For injection</td></tr><tr><td>34 gauge needle</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td>For injection</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td><td>Anesthetizing fish</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3539</td><td>For embryo drug treatment</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Bel-art product</td><td>F37898</td><td>For transfering embryo</td></tr></tbody></table>

a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish

Der genetisch zugänglich Erwachsene Zebrabärbling (Danio Rerio) wurde zunehmend als ein Wirbeltier Modell eingesetzt, für das Verständnis menschlicher Erkrankungen wie z. B. Kardiomyopathie. Wegen seiner Bequemlichkeit und Bereitschaft zu hoher Durchsatz genetische Manipulationen öffnet die Generation der erworbenen Kardiomyopathie Modelle, wie Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie (DIC) Modell in Erwachsenen Zebrafisch, die Türen für neue Forschungsansätze, einschließlich Kardiomyopathie Modifikatoren über vorwärts genetisches Screening zu entdecken. Anders als bei der embryonalen Zebrafisch-DIC-Modell, Initiale akute und später chronische Phasen der Kardiomyopathie kann im Erwachsenen Zebrafisch DIC Modell ermöglicht die Untersuchung der Bühne-abhängige Signalisierung Mechanismen und therapeutische Strategien bestimmt werden. Allerdings erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse mit dem aktuellen Modell, auch in den Händen von erfahrenen Ermittlern. Um zukünftige Umsetzung des DIC-Modells zu erleichtern, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zum Generieren dieser DIC-Modell im Erwachsenen Zebrafisch und zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion (IP) zu beschreiben. Wir diskutieren weiter Optionen zur Verringerung der Varianten, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und geben Anregungen, wie Sie die Ergebnisse richtig zu interpretieren.

Hier sind zwei Methoden, um IP-Injektion zu Modell DIC in Erwachsenen Zebrafisch durchführen präsentiert. Bei der Verwendung der klassischen, etablierten IP-Injektion Methode29, wurde festgestellt, dass die injizierte DOX-Lösung (rote Farbe) vom Standort manchmal heraus sickern könnte wo die Nadel eingedrungen. Die alternative IP-Injektion verwendet einen anderen Speicherort für Nadel-Durchdringung, die 3-4 mm entfernt das Peritoneum ist, wo die DOX freigesetz...

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A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie Model in Erwachsenen Zebrafisch

Eine Methode zur Erzeugung einer Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie-Modell im Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) wird hier beschrieben. Zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion werden vorgestellt und Bedingungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen werden diskutiert.

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

a-doxorubicin-induced-cardiomyopathy-model-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Aufrufe.  Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Eine Methode zur Erzeugung einer Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie-Modell im Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) wird hier beschrieben. Zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion werden vorgestellt und Bedingungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen werden diskutiert.

Serie: A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

Forschung

Medizin

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Entwicklungsbiologie

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its embryonic transparency, genetic tractability, and amenity to rapid, high-throughput studies. However, the loss of transparency limits heart function analysis at the adult stage, which complicates modeling of age-related heart conditions. To overcome such limitations, high-frequency ultrasound echocardiography in zebrafish is emerging as a viable option. Here, we present a detailed protocol to assess cardiac function in adult zebrafish by non-invasive echocardiography using high-frequency ultrasound. The method allows visualization and analysis of zebrafish heart dimension and quantification of important functional parameters, including heart rate, stroke volume, cardiac output, and ejection fraction. In this method, the fish are anesthetized and kept underwater and can be recovered after the procedure. Although high-frequency ultrasound is an expensive technology, the same imaging platform can be used for different species (e.g., murine and zebrafish) by adapting different transducers. Zebrafish echocardiography is a robust method for cardiac phenotyping, useful in the validation and characterization of disease models, particularly late-onset diseases; drug screens; and studies of heart injury, recovery, and regenerative capacity.

We describe a protocol to assess heart morphology and function in adult zebrafish using high-frequency echocardiography. The method allows visualization of the heart and subsequent quantification of functional parameters, such as heart rate (HR), cardiac output (CO), fractional area change (FAC), ejection fraction (EF), and blood inflow and outflow velocities.

Hochfrequenz-Ultraschall-Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biologie

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Optimierte intraperitoneale Injektion für die Verabreichung von Verbindungen in erwachsenen Zebrafischen

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as cardiomyopathy. Intraperitoneal (IP) injection is an important method that delivers compounds to the body for either testing therapeutic effects or generating disease models such as doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC). Currently, there are two methods of IP injection. Both&#160;methods have limitations when handling toxic compounds such as doxorubicin, which result in side effects manifesting as severe damage to the body shape and fish death. While these shortcomings could be overcome by extensive investigator training, a new IP injection method that has minimal side effects is desirable. Here, a unique IP injection method that is able to handle toxic compounds is reported. Consistently reduced cardiac function can result without incurring significant fish death. The technique can be easily mastered by researchers who have minimal experience with adult zebrafish.

Autor im Rampenlicht: Neuartige intraperitoneale Injektionsmethode für Zebrafisch-Kardiotoxizitätsmodelle

A new intraperitoneal (IP) injection method in adult zebrafish is described. When handling toxic compounds such as doxorubicin, this procedure is more effective than the two previously reported IP methods. The technique is designed to be easily adopted by researchers with limited experience in the zebrafish model.

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie Model in Erwachsenen Zebrafisch

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Hochfrequenz-Ultraschall-Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert