Name: a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish
Uploaded: 2018-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de desenvolvimento cientista da associação americana do coração (14SDG18160021 para YD), o US NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 para XX e a Fundação de Mayo para XX.

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (academias nacionais imprensa. 2011), e foram aprovados pelo Comitê de uso e Mayo Clinic institucional Cuidado Animal.
1. adultos Zebrafish preparação
<ol><li>Configure o suficiente casais reprodutores cruzando tanques para adquirir pelo menos duas vezes como muitos como o peixe total necessário para a injeção de DOX. Se comparando peixes com diferentes origens genéticas, todos os peixes se reproduzem dentro da mesma semana para assegurar controles idade.</li>
	<li>Recolher os embriões de peixe na manhã seguinte, transferi-los para pratos de Petri de 100mm e mantê-los em uma incubadora de 28,5 ° C. Manter os embriões em uma densidade baixa (< 100 embriões/placa de Petri).</li>
	<li>Atualizar o diário da água do embrião para evitar desequilíbrios de sexo e remover manualmente os ovos mortos em tempo hábil com uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Colocar o mesmo número de embriões em cada tanque (por exemplo, 60 embriões/3 L de meio tanque inicialmente) para assegurar a densidade-controles.</li>
	<li>Comece paramécios alimentando na fertilização de pós 4 dias (dpf).</li>
	<li>Inspecione o peixe diariamente durante a fase juvenil. Ajustar o número de peixes conforme necessário para garantir o peixe similar densidade.</li>
	<li>Quando o peixe atingir 4 semanas de idade, transferi até 20 peixes para cada novo tanque médio de 3L para subsequente crescimento. Começa a alimentar o peixe com artêmias. hachuradas ao vivo.</li>
</ol>2. preparação e armazenamento da solução-mãe DOX
Nota: DOX pode ser comprado de várias empresas-bio. O composto é geralmente adquirido como um pó em recipientes de marrons escuros.
<ol><li>Dissolva completamente o pó DOX em água deionizada para assegurar que não aglomerados são visíveis, com uma concentração final de 5 mg/mL como solução-mãe. Alíquotas de 1ml de estoque DOX em cada tubo de segurança-bloqueio de 1,5 mL. Envolva os tubos de 1,5 mL com papel da folha de alumínio para proteger o DOX da exposição à luz. Nota: Execute esta etapa em uma capa de química.</li>
	<li>Manter a solução estoque de DOX a 4 ° C para armazenamento. Para armazenamento a longo prazo (> 4 semanas) de solução-mãe de DOX, executar a seção opcional 3 descrito abaixo.</li>
</ol>3. controle de qualidade da DOX utilizando embriões de peixe-zebra (opcionais)
Nota: DOX é ambos e luz-sensíveis à umidade, assim ele pode perder sua eficácia de drogas para modelagem DIC após armazenamento prolongado. Para DOX comprado de empresas diferentes, ou mesmo diferentes lotes da mesma empresa, é útil calibrar sua eficácia de drogas usando embriões de zebrafish do selvagem-tipo (WT) antes de realizar os experimentos no peixe adulto. Este método é derivado de um zebrafish relatado embrionárias DIC modelo21.
<ol><li>Colete embriões de zebrafish WT de pelo menos 2 pares de peixes. Dechorionate de embriões na pós-fertilização 24h (hpf) manualmente usando uma seringa com uma agulha de micro. Alternativamente, trate o embrião com proteinase K em concentração final de 10 µ g/mL por 10-15 min em uma incubadora de 30 ° C. Atualize a água do embrião após a dechorionation. Remover os embriões mortos e manter pelo menos 36 embriões de cada lote.</li>
	<li>Dilua a solução-estoque DOX em água fresca embrião para uma concentração final de 100 µM. O volume da solução é de 100 µ l de cada 3 embriões. Misture a solução diluída de DOX pelo vórtice. A solução diluída final deve ser uma luz, a cor vermelha.</li>
	<li>Adicione 100 µ l/poço de solução diluída de DOX de uma placa de 96 poços limpa transparente.</li>
	<li>Leve 3 embriões de dechorionated com uma pipeta de transferência de plástico e mantenha os embriões perto do fim da ponta da pipeta. Colocar a ponta da pipeta para cada poço com solução DOX. Deixe a extremidade da ponta toque a solução e permitir que os embriões a nadar dentro do poço. Nota: Evite manualmente empurrando os embriões, que irão adicionar mais água no poço e diluir a solução DOX.</li>
	<li>Atualizar a solução DOX em 48 hpf. Por esta altura, observe os poços sob um microscópio com ampliação de 10x para identificar embriões mortos (cessação dos batimentos cardíacos) ou embriões com edema. Conte e remover qualquer embriões mortos em tempo hábil, caso contrário os restantes embriões expostos à solução com embriões mortos podem morrer rapidamente também.</li>
	<li>Verifique os embriões em 72 hpf e contá-los. O tratamento de DOX é considerado "eficácia boa droga" se > 25% morte (cessação dos batimentos cardíacos) pode ser observado em ambos os lotes de embriões.</li>
</ol>4. pré-injeção preparação
Nota: O peixe de 8 semanas a 6 meses de idade é utilizados para injeção de DOX. Os pesos de corpo (BWs) de um peixe selvagem Indian cariótipo (WIK) amadurecido para ser injetado podem variar de 0,2-0,5 g.
<ol><li>Rapidamente o peixe para 24 h antes da injeção.</li>
	<li>Anestesia o peixe com água do embrião que contém metanosulfonato de 0,16 mg/mL. Use um papel de filtro limpo para secar a água de ambos os lados do corpo. Medir o BW de cada peixe em escala. Grupo peixe dentro de 10% de diferença em BW juntos para posterior injeção. Nota: Para minimizar a carga de trabalho a este passo, peixe dentro de 10% de diferença em BW é considerados o mesmo tamanho; Portanto, prepare uma solução de trabalho de DOX, de acordo com sua média de BW.</li>
	<li>Plano para injetar cada peixe adulto com 5 µ l de solução. Calcule a concentração de trabalho DOX de acordo com o número de peixes e BWs. Nota: Para estudar a cardiotoxicidade crônica acima de 6 meses, use DOX na dose de 20 mg/kg. Para estudar a cardiotoxicidade aguda de DOX, a dose DOX pode ser aumentada até 50 mg/kg de BW.</li>
	<li>Dilua o estoque DOX em 1 x solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para as concentrações de trabalho correspondente. Vórtice para misturar a solução. Brevemente spin para baixo, para recolher a solução.</li>
</ol>5. DOX injeção no peixe adulto
<ol><li>Lugar uma limpa 100 mm placa de Petri com uma esponja dentro dela, sob um microscópio de dissecação, então ajuste o foco. Corte a esponja para fazer uma cavidade de cerca de 4 cm de comprimento para segurar um peixe. Fazer uma cavidade mais para um peixe maior.</li>
	<li>Prepare uma agulha 34g com um microseringa de 10 µ l. Enxague a agulha com 1 x HBSS buffer para remover quaisquer bolhas e blocos dos tubos e de seringa.</li>
	<li>Anestesia o peixe adulto na água do embrião que contém metanosulfonato de 0,16 mg/mL por 2 min. Nota: Anesthetization prolongada mais de 5 min, seguido por injeção DOX pode facilmente causar peixes morte.</li>
	<li>Mergulhe a esponja na água de embrião com metanosulfonato e transfira o peixe sobre a esponja para injeção.</li>
	<li>
Injeção de IP DOX execute qualquer um dos dois métodos descritos abaixo.
	<ol>
<li>Clássico de injeção IP29<ol>
<li>Posicione o peixe com o abdômen acima na cavidade da esponja. Inserir a agulha, com uma 45° ângulo para o corpo do peixe em relação à linha mediana entre as nadadeiras pélvicas e penetrar cerca de 1-2 mm. libere rapidamente toda solução DOX lentamente. Aguardar 5 s antes de retirar a agulha. Verificar a entrega DOX, uma cor vermelha visível na barriga do peixe.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Injeção de IP alternativa<ol>
<li>Coloque o peixe lateralmente sobre a esponja com o anterior para a direita. Delicadamente estabilizar o peixe usando um fórceps fim brusco com a mão esquerda e segure a seringa com a mão direita.</li>
			<li>Posicione a agulha abaixo da linha lateral, acima da nadadeira pélvica, com o bisel voltado para cima. Apontando para a posição de 07:00 em um ângulo de 45 °, introduza a agulha 3 a 4 mm para a cavidade de peixe, localizada entre a pélvica e as barbatanas anais e em seguida, pressione lentamente o êmbolo. Verificar a entrega DOX, uma cor vermelha visível na barriga do peixe.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rapidamente transferi os peixes injetados para um tanque limpo cruzamento cheio de água fresca do sistema para permitir que o peixe se recuperar. Enxague a agulha uma vez com 1 buffer de x HBSS entre as injeções.</li>
</ol>6. pós-injeção peixe gestão
<ol><li>Após a injeção, retorne o peixe para o sistema com circulação em execução. Se possível, manter o peixe DOX-tratados separadamente do sistema principal para evitar a contaminação cruzada entre tanques diferentes que compartilham a circulação.</li>
	<li>Rapidamente o peixe injetado para outro 24h para recuperação. Observe os peixes diariamente durante a primeira semana. Remova os peixes mortos em tempo hábil para evitar a infecção para os outros peixes. Nota: Mortes de peixes dentro as primeiras 24 horas são provavelmente devido a lesões físicas causadas por injeção.</li>
	<li>Mais manter o peixe DOX-estressado para observações longitudinais. Remova o peixe morto no tempo para evitar infecções de outros peixes do aquário. Nota: Os números de peixes estão documentados para gerar uma curva de sobrevivência.</li>
	<li>Usar diferentes ensaios experimentais de fenótipo o peixe DOX-forçado, tais como a Ecocardiografia30, função cardíaca repórter transgénicos linha23, natação desafio26e quantificação de outros remodelamento patológico marcadores de23.</li>
</ol>

<ol>
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D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-dependent+pathways+suppress+myocardial+cell+hypertrophy.">Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).</li><li>Hershman, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+cardiac+risk+factors,+and+cardiac+toxicity+in+elderly+patients+with+diffuse+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.">Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).</li><li>Silber, J. H., Barber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+doxorubicin-induced+congestive+heart+failure.">Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.</a> Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), (2009).</li><li>Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protocol+for+the+oral+administration+of+test+chemicals+to+adult+zebrafish.">A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish.</a> Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+adult+zebrafish.">Gavaging adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesses.

Para modelar uma DIC progressiva, a dose de 20 mg/kg DOX foi determinada experimentalmente como a dose mais elevada que não causa morte de peixes significativo durante 1 wpi mas ainda resultados na morte de peixes e a redução da função cardíaca após 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Esta dose é comparável aos frequentemente usados em modelos de roedores DIC (15-25 mg/kg) e para a dose cumulativa de limite em humanos (550 mg/m2, que é equivalente...

Doxorrubicina (DOX), também chamada Adriamicina, foi desenvolvida como uma droga anti-neoplásicos desde a década de 1960,1,2. Agora é ainda ativamente utilizado como uma droga de quimioterápico importante para um amplo espectro de tumores. No entanto, aplicação clínica da DOX foi prejudicada por sua toxicidade dose-dependente, especialmente a cardiotoxicidade caracterizada por sintomas variáveis, variando de alterações eletrocardiográficas assintomáticas a pericardite e descompensada cardiomiopatia 1 , 2. até à data, pelo menos, três grandes hipóteses têm sido levantadas para explicar a DIC, incluindo registrados reativas de oxigênio (ROS) de espécies1,3,4,5, inibição da topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7e modulação de cálcio intracelular release1,8,9. Acumular evidência também sugere predisposição genética como fator de risco importante para DIC10,11,12,13. Identidades de gene relacionado com estas predisposições DIC, no entanto, permanecem em grande parte desconhecidos. Dexrazoxane é o único agente adjuvante aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para tratar o DIC, mas com aplicação limitada14,15,16, ressaltando a necessidade de identificar adicionais estratégias terapêuticas. Modelos animais de DIC, portanto, são explorados para estes fins. Devido à sua acessibilidade e simplicidade, mecanicistas estudos sobre modelos DIC potencialmente poderiam ter impactos mais amplos em outros tipos de cardiomiopatias: patogênese comum pode ser compartilhado entre cardiomiopatias de diferentes etiologias, especialmente à tarde estágios patológicos17,18,19,20.
Além de modelos de roedores de DIC, modelos DIC zebrafish com uma taxa de transferência foram desenvolvidos para facilitar a descoberta de novos fatores genéticos e terapêutica. Um modelo DIC embrionário foi estabelecido nos embriões de peixe-zebra transparente para a seleção de compostos terapêuticos21. Dado que as miocardiopatias são doenças de início adulto com uma patogênese progressiva, cardiomiopatia zebrafish adulto modelos têm sido desenvolvidos22,23,24,25,26. Geramos o primeiro modelo adquirido para cardiomiopatia resultante da anemia crônica24, seguido por DIC como o segundo modelo de cardiomiopatia adquirida no zebrafish adultos23. Nós achamos que a injeção de um único bolus de DOX em zebrafish adulto induz cardiotoxicidade que consiste de uma fase aguda, mais ou menos dentro de injeção de pós de 1 semana (wpi), seguida por uma fase crônica de cardiomiopatia de injeção após 6 meses. Enquanto haploinsuficiência do alvo da rapamicina mecanicista(mtor) melhora a cardiomiopatia na fase crônica, ele exagera peixe mortalidade na fase aguda, ressaltando o valor do modelo adulto DIC para discernir a fase dependente mecanismos de23. Mais demonstrámos que o modelo DIC adulto pode ser usado para salientar uma coleção de zebrafish insercional cardíaca (ZIC) mutantes que estão sendo gerados através de uma abordagem de mutagênese insercional baseados em transposon27. Uma tela piloto identificado 3 genes de cardiomiopatia conhecida bem como DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B e membro 6b (dnajb6b) como novo DIC genes de suscetibilidade28. Portanto, a geração do modelo adulto DIC no zebrafish levou a uma nova metodologia que permite a identificação de modificadores genéticos para DIC, que complementa o estudo de associação de genoma-largo existente (GWAS) e locus traço quantitativos (QTL sistematicamente ) análise.
Durante a geração e implementação do modelo adulto zebrafish DIC, notamos variações significativas entre os diferentes pesquisadores e/ou mesmo entre diferentes injecções realizadas pelo mesmo investigador. A natureza longitudinal do modelo impõe desafios para registrar os resultados de diferentes investigadores e ao processo de solução de problemas sequencial. Para facilitar o uso desse método simples stress induzindo cardiomiopatia pela comunidade de pesquisa, descrevemos nosso protocolo detalhadamente, presentes dois tipos de injeção do IP e discutir considerações para reduzir as variações entre diferentes pesquisadores.

<table><tbody><tr><td>Crossing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Fish breeding</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Maintaining embryo</td></tr><tr><td>3 L medium tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZT280</td><td>Maintaining fish</td></tr><tr><td>Paramecia</td><td>Carolina</td><td>131560</td><td>Food for juvenile fish</td></tr><tr><td>Live hatched brine shrimp</td><td>in house</td><td></td><td>Food for adult fish</td></tr><tr><td>Doxorubicin hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tube</td><td>Eppendorf</td><td>No. 022363204</td><td>For drug storage</td></tr><tr><td>Aluminum foil paper</td><td>Fisher</td><td>1213104</td><td>For preventing light exposure</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>No. 03115887001</td><td>For dechorionating embryo</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025076</td><td>Vehicle for DOX</td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Falcon</td><td>431741</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L NanoFil micro-syringe</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>For injection</td></tr><tr><td>34 gauge needle</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td>For injection</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td><td>Anesthetizing fish</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3539</td><td>For embryo drug treatment</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Bel-art product</td><td>F37898</td><td>For transfering embryo</td></tr></tbody></table>

a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish

O geneticamente acessível adulto peixe-zebra (Danio rerio) tem sido cada vez mais usado como um modelo de vertebrados para a compreensão de doenças humanas, tais como cardiomiopatia. Devido à sua conveniência e acessibilidade para manipulações genéticas de alta produtividade, a geração de modelos de cardiomiopatia adquirida, como o modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina (DIC) no zebrafish adulto, está abrindo as portas para novos caminhos de pesquisa, inclusive descobrindo modificadores de cardiomiopatia através de rastreamento genético para a frente. Diferente do modelo embrionário zebrafish DIC, tanto inicial aguda e posteriormente crônicas fases de cardiomiopatia podem ser determinadas no modelo adulto zebrafish DIC, permitindo o estudo dos mecanismos de sinalização dependente de palco e estratégias terapêuticas. No entanto, a variáveis resultados podem ser obtidos com o modelo atual, mesmo nas mãos de investigadores experientes. Para facilitar a futura implementação do modelo de DIC, apresentamos um protocolo detalhado sobre como gerar este modelo DIC no zebrafish adulto e descrever duas maneiras alternativas de injeção intraperitoneal (IP). Vamos voltar a discutir opções sobre como reduzir variações para obter resultados fiáveis e fornece sugestões sobre como interpretar adequadamente os resultados.

Aqui, apresentam-se dois métodos para executar a injeção de IP para modelo DIC no zebrafish adulto. Enquanto estiver usando o clássico, estabeleceu IP injeção método29, verificou-se que a solução DOX injetada (cor vermelha) às vezes pode escorrer para fora do local onde a agulha penetrou. A injeção de IP alternativa usa um local diferente para a penetração da agulha é de 3-4 mm longe o peritônio onde o DOX é liberado (figura 1A...

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A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Um modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina no Zebrafish adulto

Um método para gerar um modelo de cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em adulto peixe-zebra (Danio rerio) é descrito aqui. Apresentam-se duas formas alternativas de injeção intraperitoneal e condições para reduzir as variações entre diferentes grupos experimentais são discutidas.

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

a-doxorubicin-induced-cardiomyopathy-model-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K visualizações.  Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Um método para gerar um modelo de cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em adulto peixe-zebra (Danio rerio) é descrito aqui. Apresentam-se duas formas alternativas de injeção intraperitoneal e condições para reduzir as variações entre diferentes grupos experimentais são discutidas.

Vídeo: A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

Indução de Infarto do Miocárdio em Zebrafish adultos usando Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

Medicina

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

Análise de deslocamento da Deformação Mecânica Miocárdica (DIAMANTE) revela heterogeneidade segmental da função cardíaca em zebrafish embrionário

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Biologia do Desenvolvimento

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its embryonic transparency, genetic tractability, and amenity to rapid, high-throughput studies. However, the loss of transparency limits heart function analysis at the adult stage, which complicates modeling of age-related heart conditions. To overcome such limitations, high-frequency ultrasound echocardiography in zebrafish is emerging as a viable option. Here, we present a detailed protocol to assess cardiac function in adult zebrafish by non-invasive echocardiography using high-frequency ultrasound. The method allows visualization and analysis of zebrafish heart dimension and quantification of important functional parameters, including heart rate, stroke volume, cardiac output, and ejection fraction. In this method, the fish are anesthetized and kept underwater and can be recovered after the procedure. Although high-frequency ultrasound is an expensive technology, the same imaging platform can be used for different species (e.g., murine and zebrafish) by adapting different transducers. Zebrafish echocardiography is a robust method for cardiac phenotyping, useful in the validation and characterization of disease models, particularly late-onset diseases; drug screens; and studies of heart injury, recovery, and regenerative capacity.

We describe a protocol to assess heart morphology and function in adult zebrafish using high-frequency echocardiography. The method allows visualization of the heart and subsequent quantification of functional parameters, such as heart rate (HR), cardiac output (CO), fractional area change (FAC), ejection fraction (EF), and blood inflow and outflow velocities.

Ecocardiografia de ultrassom de alta frequência para avaliar a função cardíaca de zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biologia

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

Eletrocardiografia de superfície vivo para zebrafish adulto

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Injeção intraperitoneal otimizada para entrega de compostos em peixe-zebra adulto

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as cardiomyopathy. Intraperitoneal (IP) injection is an important method that delivers compounds to the body for either testing therapeutic effects or generating disease models such as doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC). Currently, there are two methods of IP injection. Both&#160;methods have limitations when handling toxic compounds such as doxorubicin, which result in side effects manifesting as severe damage to the body shape and fish death. While these shortcomings could be overcome by extensive investigator training, a new IP injection method that has minimal side effects is desirable. Here, a unique IP injection method that is able to handle toxic compounds is reported. Consistently reduced cardiac function can result without incurring significant fish death. The technique can be easily mastered by researchers who have minimal experience with adult zebrafish.

Autor em destaque: Novo método de injeção intraperitoneal para modelos de cardiotoxicidade de peixe-zebra

A new intraperitoneal (IP) injection method in adult zebrafish is described. When handling toxic compounds such as doxorubicin, this procedure is more effective than the two previously reported IP methods. The technique is designed to be easily adopted by researchers with limited experience in the zebrafish model.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

Um modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina no Zebrafish adulto

Resumo

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Indução de Infarto do Miocárdio em Zebrafish adultos usando Cryoinjury

Análise de deslocamento da Deformação Mecânica Miocárdica (DIAMANTE) revela heterogeneidade segmental da função cardíaca em zebrafish embrionário

Ecocardiografia de ultrassom de alta frequência para avaliar a função cardíaca de zebrafish

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Eletrocardiografia de superfície vivo para zebrafish adulto

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada