Name: a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish
Uploaded: 2018-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di sviluppo scienziato dal Associazione americana del cuore (14SDG18160021 a YD), gli Stati Uniti NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 a XX e la Fondazione di Mayo a XX.

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. 2011), e sono stati approvati dal comitato di uso e Mayo Clinic istituzionale Animal Care.
1. adulto Zebrafish preparazione
<ol><li>Impostare sufficienti coppie riproduttrici in attraversamento serbatoi per acquisire almeno due volte come molti come il pesce totale necessario per l'iniezione di DOX. Se confronto pesce con diverso background genetico, allevare pesci tutti nella stessa settimana per garantire controlli di pari età.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni di pesce la mattina successiva, trasferirli a 100mm di Petri e tenerli in un'incubatrice di 28,5 ° C. Mantenere gli embrioni a bassa densità (< 100 embrioni/Petri dish).</li>
	<li>Aggiornare l'embrione acqua ogni giorno per evitare squilibri di sesso e rimuovere manualmente le uova morte in modo tempestivo, utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Mettere lo stesso numero di embrioni in ciascun serbatoio (ad esempio, 60 embrioni/3 L mezzo serbatoio inizialmente) per garantire controlli appaiati densità.</li>
	<li>Avviare Paramisha alimentazione al momento della post-fecondazione 4 giorni (dpf).</li>
	<li>Ispezionare il pesce tutti i giorni durante la fase giovanile. Regolare il numero di pesci come necessario per garantire pesci simili densità.</li>
	<li>Quando pesce raggiunge 4 settimane di età, trasferire fino a 20 pesci in ogni nuovo carro armato medio 3 L per un'ulteriore crescita. Iniziare a nutrire i pesci con Artemia tratteggiato dal vivo.</li>
</ol>2. preparazione e conservazione della soluzione di riserva di DOX
Nota: DOX può essere acquistato da vari bio-aziende. Il composto si acquista solitamente come una polvere in contenitori marrone scuri.
<ol><li>Sciogliere completamente la polvere DOX in acqua deionizzata per garantire che grumi non sono visibili, con una concentrazione finale di 5 mg/mL come soluzione di riserva. Aliquotare 1 mL di stock DOX in ogni provetta di sicuro-blocco di 1,5 mL. Avvolgere le provette da 1,5 mL con foglio di carta alluminio per proteggere il DOX da esposizione alla luce. Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa chimica.</li>
	<li>Tenere la soluzione di riserva di DOX a 4 ° C per la conservazione. Per l'archiviazione a lungo termine (> 4 settimane) di soluzione di riserva di DOX, eseguire la sezione opzionale 3 descritto di seguito.</li>
</ol>3. controllo di qualità di DOX utilizzando embrioni di Zebrafish (opzionali)
Nota: DOX è entrambi sensibili all'umidità e luce-, quindi può perdere la sua efficacia del farmaco per la modellazione DIC Dopo stoccaggio prolungato. Per DOX acquistati da aziende diverse, o anche diversi lotti della stessa azienda, è utile calibrare la sua efficacia di droga utilizzando embrioni di zebrafish di wild type (WT) prima di condurre esperimenti sui pesci adulti. Questo metodo è derivato da un segnalato zebrafish embrionali DIC modello21.
<ol><li>Raccogliere gli embrioni di zebrafish WT da almeno 2 paia di pesce. Dechorionate embrioni alle 24h post-fertilizzazione (hpf) manualmente utilizzando una siringa con un micro ago. In alternativa, è possibile trattare l'embrione con proteinasi K a concentrazione finale di 10 µ g/mL per 10-15 min in un incubatore a 30 ° C. Aggiornare l'acqua embrione dopo dechorionation. Rimuovere embrioni morti e mantenere almeno 36 embrioni di ogni lotto.</li>
	<li>Diluire la soluzione stock di DOX in embrione fresco acqua ad una concentrazione finale di 100 µM. Il volume della soluzione è di 100 µ l per ogni 3 embrioni. Mescolare la soluzione diluita di DOX Vortex. La soluzione finale diluita deve essere una luce, colore rosso.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione diluita di DOX di un piatto trasparente pulito 96 pozzetti.</li>
	<li>Prendere 3 dechorionated embrioni con una pipetta di trasferimento in plastica e mantenere gli embrioni vicino alla fine della punta della pipetta. Mettere la punta della pipetta in tutti i pozzetti con soluzione DOX. Lasciate che la punta di toccare la soluzione ed gli embrioni a nuotare nel pozzo. Nota: Evitare di spingere manualmente gli embrioni, che aggiungerà più acqua nel pozzo e diluire la soluzione DOX.</li>
	<li>Aggiornare la soluzione DOX 48 hpf. Da questo momento, osservare i pozzi sotto un microscopio con ingrandimento 10x per identificare embrioni morti (cessazione del battito cardiaco) o embrioni con l'edema. Contare e rimuovere eventuali embrioni morti in modo tempestivo, altrimenti i rimanenti embrioni esposti alla soluzione con embrioni morti possono morire rapidamente pure.</li>
	<li>Verifica gli embrioni a 72 hpf e contarli. Il trattamento di DOX è considerato "l'efficacia dei farmaci buono" se > 25% morte (cessazione del battito cardiaco) può essere osservata in entrambi i batch di embrioni.</li>
</ol>4. pre-iniezione preparazione
Nota: Pesce di 8 settimane a 6 mesi di età sono utilizzati per l'iniezione di DOX. Il peso corporeo (BWs) di un pesce selvatico indiano Karyotype (WIK) stagionato deve essere iniettato può variare da 0,2-0,5 g.
<ol><li>Velocemente il pesce per 24 h prima dell'iniezione.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce con acqua ed embrione tricaina 0,16 mg/mL. Utilizzare un filtro di carta pulito per asciugare l'acqua da entrambi i lati del corpo. Misurare il BW di ogni pesce su una scala. Gruppo i pesci all'interno di 10% di differenza in BW successiva iniezione. Nota: Per ridurre al minimo il carico di lavoro in questa fase, pesci all'interno di 10% di differenza in BW sono considerati la stessa dimensione; quindi, preparare una soluzione di lavoro di DOX secondo loro media BW.</li>
	<li>Prevede di iniettare ogni pesce adulto con 5 µ l di soluzione. Calcolare la concentrazione di DOX lavoro secondo i numeri di pesci e BWs. Nota: Per studio cardiotossicità cronica fino a 6 mesi, utilizzare DOX ad una dose di 20 mg/kg. Per studiare la cardiotossicità acuta di DOX, la dose DOX può essere aumentata fino a 50 mg/kg di BW.</li>
	<li>Diluire lo stock DOX 1 x soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per concentrazioni di lavoro corrispondenti. Vortice per miscelare la soluzione. Brevemente di rotazione verso il basso per raccogliere la soluzione.</li>
</ol>5. DOX iniezione in pesci adulti
<ol><li>Posto un 100mm pulito Petri con una spugna all'interno di esso, sotto un microscopio di dissezione, quindi regolare la messa a fuoco. Tagliare il Pan di Spagna per rendere una cavità di circa 4 cm di lunghezza per tenere un pesce. Fare una cavità più lungo per un pesce più grande.</li>
	<li>Preparare un ago 34 G con un 10 µ l micro-siringa. Sciacquare l'ago con 1 x HBSS buffer per rimuovere eventuali bolle e blocchi dalla siringa e tubazione.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce adulto in embrione acqua contenente tricaina 0,16 mg/mL per 2 min. Nota: Amputate prolungata oltre 5 min seguito da iniezione di DOX può facilmente causare pesce morte.</li>
	<li>Mettere a bagno la spugna in acqua di embrione con tricaina e trasferire il pesce su spugna per iniezione.</li>
	<li>
Eseguire l'iniezione di DOX IP da uno dei due metodi descritti di seguito.
	<ol>
<li>Classico IP iniezione29<ol>
<li>Posizionare il pesce con l'addome fino nella cavità della spugna. Inserire l'ago, con un 45° angolo per il corpo dei pesci in linea mediana tra le pinne pelviche e penetrare circa 1-2 mm. rilasciare rapidamente tutta la soluzione di DOX lentamente. Attendere 5 s prima di estrarre l'ago. Controllare che la fornitura DOX di un colore rosso visibile nel ventre del pesce.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Iniezione del IP alternativo<ol>
<li>Mettere il pesce lateralmente sulla spugna con l'anteriore a destra. Delicatamente stabilizzare il pesce utilizzando una pinzetta punta smussata con la mano sinistra e tenere la micro-siringa con la mano destra.</li>
			<li>Posizionare l'ago sotto la linea laterale sopra la pinna pelvica, con lo smusso rivolto verso l'alto. Puntando alla posizione 7 in un angolo di 45 °, inserire l'ago 3-4 mm alla cavità di pesce situata tra il bacino e le pinne anali e poi premere lentamente lo stantuffo. Controllare che la fornitura DOX di un colore rosso visibile nel ventre del pesce.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire velocemente il pesce iniettato su un incrocio pulito serbatoio riempito con acqua fresca sistema per consentire il pesce recuperare. Sciacquare l'ago una volta con 1 tampone di x HBSS tra le iniezioni.</li>
</ol>6. dopo l'iniezione pesce Management
<ol><li>Dopo l'iniezione, è possibile restituire il pesce al sistema con l'esecuzione di circolazione. Se possibile, mantenere pesce DOX-trattati separatamente dal sistema principale per evitare la contaminazione incrociata tra i diversi serbatoi che condividono la circolazione.</li>
	<li>Veloce il pesce iniettato per altre 24 ore per il recupero. Osservare il pesce tutti i giorni durante la prima settimana. Togliere il pesce morto in modo tempestivo per evitare il contagio di altri pesci. Nota: Pesci morti entro le prime 24 ore sono probabilmente a causa di lesioni fisiche causate tramite l'iniezione.</li>
	<li>Inoltre mantenere il pesce DOX-sollecitato per osservazioni longitudinali. Rimuovere i pesci morti in tempo per evitare le infezioni di altri pesci nella vasca. Nota: I numeri di pesci sono documentati per generare una curva di sopravvivenza.</li>
	<li>Utilizzare diversi saggi sperimentali al fenotipo dei pesci DOX-sollecitato, quali ecocardiografia30, funzione cardiaca reporter transgenici linea23, nuotare sfida26e quantificazione degli altri rimodellamento patologico marcatori23.</li>
</ol>

<ol>
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D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-dependent+pathways+suppress+myocardial+cell+hypertrophy.">Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).</li><li>Hershman, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+cardiac+risk+factors,+and+cardiac+toxicity+in+elderly+patients+with+diffuse+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.">Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).</li><li>Silber, J. H., Barber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+doxorubicin-induced+congestive+heart+failure.">Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.</a> Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), (2009).</li><li>Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protocol+for+the+oral+administration+of+test+chemicals+to+adult+zebrafish.">A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish.</a> Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).</li><li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavaging+adult+zebrafish.">Gavaging adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.

Per modellare un DIC progressivo, la dose di 20 mg/kg DOX è stata determinata sperimentalmente come la dose massima che non provoca morte significativa dei pesci durante 1 wpi ma ancora risultati nella morte dei pesci e la riduzione della funzione cardiaca dopo 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Questa dose è paragonabile a quelli frequentemente utilizzati nei modelli del roditore di DIC (15-25 mg/kg) e la dose cumulativa di limite in esseri umani (550 mg/m2</...

Doxorubicina (DOX), anche denominato adriamicina, è stato sviluppato come un farmaco anti-tumorale dai anni 19601,2. Ora è ancora attivamente usato come un farmaco chemioterapico importante per un ampio spettro di tumori. Tuttavia, applicazione clinica di DOX è stata ostacolata dalla sua tossicità dose-dipendente, soprattutto cardiotossicità caratterizzata da sintomi variabili che vanno da cambiamenti elettrocardiografici asintomatici a pericardite e scompensata cardiomiopatia 1 , 2. ad oggi, almeno tre ipotesi principali sono state sollevate per spiegare DIC, tra cui attivato reattive dell'ossigeno (ROS) specie1,3,4,5, inibizione della topoisomerasi II-β ( TOP2β)6,7e la modulazione del calcio intracellulare rilasciare1,8,9. Raccogliendo la prova suggerisce anche la predisposizione genetica come fondamentale fattore di rischio per DIC10,11,12,13. Identità di gene relativo a queste predisposizioni di DIC, tuttavia, rimangono in gran parte sconosciuti. Dexrazoxano è l'unico agente adiuvante approvato per la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento di DIC, ma con limitata attuazione14,15,16, sottolineando la necessità di individuare ulteriori strategie terapeutiche. Modelli animali di DIC sono quindi esplorati per questi scopi. A causa della loro semplicità e accessibilità, studi meccanicistici su modelli DIC potrebbero avere conseguenze più ampie su altri tipi di cardiomiopatie: patogenesi comune potrebbero essere condivisa tra cardiomiopatie delle eziologie differenti, soprattutto a seguito fasi patologiche17,18,19,20.
Oltre ai modelli del roditore di DIC, modelli DIC zebrafish con un throughput più elevato sono stati sviluppati per facilitare la scoperta di nuovi fattori genetici e di terapeutica. Un modello embrionale di DIC è stato stabilito negli embrioni di zebrafish trasparente per lo screening di composti terapeutici21. Dato che le cardiomiopatie sono malattie di inizio adulto con una patogenesi progressiva, cardiomiopatia di zebrafish adulto modelli sono stati sviluppati22,23,24,25,26. Abbiamo generato il primo modello acquisito per cardiomiopatia derivanti da anemia cronica24, seguita da DIC come il secondo modello di cardiomiopatia acquisite in zebrafish adulto23. Abbiamo trovato che l'iniezione di un singolo bolo di DOX in zebrafish adulto induce la cardiotossicità che consiste in una fase acuta all'incirca entro 1 settimana post-iniezione (wpi), seguita da una fase cronica di cardiomiopatia post-all'iniezione 6 mesi. Mentre aploinsufficienza del meccanicistico bersaglio della rapamicina(mtor) migliora la cardiomiopatia nella fase cronica, si esagera mortalità dei pesci alla fase acuta, sottolineando il valore del modello adulto DIC a discernere fase-dipendente meccanismi di23. Abbiamo inoltre dimostrato che il modello DIC adulto può essere utilizzato per sollecitare una raccolta di zebrafish cardiaco (ZIC) mutanti inserzionali che vengono generati tramite un approccio basato su trasposone mutagenesi inserzionale27. Un pilota schermo identificato 3 geni noti cardiomiopatia così come DnaJ (Hsp40) omologo, sottofamiglia B e membro 6b (dnajb6b) come nuova DIC suscettibilità geni28. Di conseguenza, la generazione del modello adulto DIC in zebrafish hanno portato a una nuova metodologia che sistematicamente consente l'identificazione di geni modificatori per DIC, che integra il studio di associazione genome-wide esistente (GWAS) e quantitative trait locus (QTL ) analisi.
Durante la generazione e l'attuazione del modello DIC zebrafish adulto, abbiamo notato variazioni significative tra i diversi ricercatori e/o anche tra diverse iniezioni eseguite dallo sperimentatore stesso. La natura longitudinale del modello impone sfide alla registrazione risultati da diversi ricercatori e al processo di risoluzione dei problemi sequenza. Per facilitare l'uso di questo semplice metodo di stress che inducono cardiomiopatia di comunità di ricerca, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio, presenti due tipi di iniezione del IP e discutere considerazioni per ridurre le variazioni tra i diversi ricercatori.

<table><tbody><tr><td>Crossing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Fish breeding</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Maintaining embryo</td></tr><tr><td>3 L medium tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZT280</td><td>Maintaining fish</td></tr><tr><td>Paramecia</td><td>Carolina</td><td>131560</td><td>Food for juvenile fish</td></tr><tr><td>Live hatched brine shrimp</td><td>in house</td><td></td><td>Food for adult fish</td></tr><tr><td>Doxorubicin hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tube</td><td>Eppendorf</td><td>No. 022363204</td><td>For drug storage</td></tr><tr><td>Aluminum foil paper</td><td>Fisher</td><td>1213104</td><td>For preventing light exposure</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>No. 03115887001</td><td>For dechorionating embryo</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025076</td><td>Vehicle for DOX</td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Falcon</td><td>431741</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L NanoFil micro-syringe</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>For injection</td></tr><tr><td>34 gauge needle</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td>For injection</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td><td>Anesthetizing fish</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3539</td><td>For embryo drug treatment</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Bel-art product</td><td>F37898</td><td>For transfering embryo</td></tr></tbody></table>

a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish

Il geneticamente accessibile adulto zebrafish (Danio rerio) è stato utilizzato sempre più come un modello di vertebrati per comprendere le malattie umane quali cardiomiopatia. Per la sua comodità e disponibilità a manipolazioni genetiche a resa elevata, la generazione di modelli acquisiti cardiomiopatia, ad esempio il modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC) in zebrafish adulto, sta aprendo le porte a nuove vie di ricerca, tra cui scoprire modificatori di cardiomiopatia tramite screening genetico in avanti. Diverso dal modello DIC zebrafish embrionali, sia iniziale acuta e poi croniche fasi di cardiomiopatia possono essere determinate nel modello zebrafish adulto DIC, consentendo lo studio dei meccanismi di segnalazione di fase-dipendente e strategie terapeutiche. Tuttavia, la variabili risultati possono essere ottenuti con il modello attuale, anche nelle mani di esperti ricercatori. Per facilitare la futura attuazione del modello DIC, presentiamo un protocollo dettagliato su come generare questo modello DIC in zebrafish adulto e descrivere due modi alternativi di iniezione intraperitoneale (IP). Più ulteriormente discutiamo le opzioni su come ridurre le variazioni per ottenere risultati affidabili e fornire suggerimenti su come interpretare correttamente i risultati.

Qui, vengono presentati due metodi per eseguire l'iniezione di IP al modello DIC in zebrafish adulto. Mentre si utilizza il classico, istituito IP metodo di iniezione29, è stato notato che la soluzione iniettata di DOX (colore rosso) potrebbe a volte fuoriuscita dalla posizione dove l'ago ha penetrato. L'iniezione di IP alternativa utilizza un percorso diverso per la penetrazione dell'ago che è 3-4 mm dal peritoneo dove viene rilasciato il DOX (<strong class="xfi...

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A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in Zebrafish adulto

Un metodo per generare un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in adulto zebrafish (Danio rerio) è descritto qui. Vengono presentati due modi alternativi di iniezione intraperitoneale e le condizioni per ridurre le variazioni tra i diversi gruppi sperimentali sono discusse.

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

a-doxorubicin-induced-cardiomyopathy-model-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Views.  Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Un metodo per generare un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in adulto zebrafish (Danio rerio) è descritto qui. Vengono presentati due modi alternativi di iniezione intraperitoneale e le condizioni per ridurre le variazioni tra i diversi gruppi sperimentali sono discusse.

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

L&#39;induzione di infarto miocardico in Zebrafish adulti usando Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

Ricerca

Medicina

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

L'analisi dello spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND) rivela l'eterogeneità segmentale della funzione cardiaca nel pesce zebra embrionale

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Biologia dello sviluppo

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its embryonic transparency, genetic tractability, and amenity to rapid, high-throughput studies. However, the loss of transparency limits heart function analysis at the adult stage, which complicates modeling of age-related heart conditions. To overcome such limitations, high-frequency ultrasound echocardiography in zebrafish is emerging as a viable option. Here, we present a detailed protocol to assess cardiac function in adult zebrafish by non-invasive echocardiography using high-frequency ultrasound. The method allows visualization and analysis of zebrafish heart dimension and quantification of important functional parameters, including heart rate, stroke volume, cardiac output, and ejection fraction. In this method, the fish are anesthetized and kept underwater and can be recovered after the procedure. Although high-frequency ultrasound is an expensive technology, the same imaging platform can be used for different species (e.g., murine and zebrafish) by adapting different transducers. Zebrafish echocardiography is a robust method for cardiac phenotyping, useful in the validation and characterization of disease models, particularly late-onset diseases; drug screens; and studies of heart injury, recovery, and regenerative capacity.

We describe a protocol to assess heart morphology and function in adult zebrafish using high-frequency echocardiography. The method allows visualization of the heart and subsequent quantification of functional parameters, such as heart rate (HR), cardiac output (CO), fractional area change (FAC), ejection fraction (EF), and blood inflow and outflow velocities.

Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biologia

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

Elettrocarcardio in superficie in vivo per il pesce zebra adulto

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

Iniezione intraperitoneale ottimizzata per la somministrazione di composti in zebrafish adulti

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as cardiomyopathy. Intraperitoneal (IP) injection is an important method that delivers compounds to the body for either testing therapeutic effects or generating disease models such as doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC). Currently, there are two methods of IP injection. Both&#160;methods have limitations when handling toxic compounds such as doxorubicin, which result in side effects manifesting as severe damage to the body shape and fish death. While these shortcomings could be overcome by extensive investigator training, a new IP injection method that has minimal side effects is desirable. Here, a unique IP injection method that is able to handle toxic compounds is reported. Consistently reduced cardiac function can result without incurring significant fish death. The technique can be easily mastered by researchers who have minimal experience with adult zebrafish.

Autore in primo piano: Nuovo metodo di iniezione intraperitoneale per modelli di cardiotossicità del pesce zebra

A new intraperitoneal (IP) injection method in adult zebrafish is described. When handling toxic compounds such as doxorubicin, this procedure is more effective than the two previously reported IP methods. The technique is designed to be easily adopted by researchers with limited experience in the zebrafish model.

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

Un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in Zebrafish adulto

Riepilogo

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Capitoli in questo video

L'induzione di infarto miocardico in Zebrafish adulti usando Cryoinjury

L'analisi dello spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND) rivela l'eterogeneità segmentale della funzione cardiaca nel pesce zebra embrionale

Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Elettrocarcardio in superficie in vivo per il pesce zebra adulto

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata