Wir danken V. Zimmermann für hervorragende technische Assistenz und Pflege für die Fische. 310000_120611: Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation, Grant-Nummer unterstützt.

1. Ausstattung Set-up <ol><li> Das wichtigste Instrument zur cryoinjury durchzuführen ist die Kryosonde, die Stift-ähnliches Instrument, das aus rostfreiem Stahl (Abbildung 1A) hergestellt wird. Der zylindrische Griff 40 mm lang und hat einen Durchmesser von 8 mm. Die Spitze des Applikators ist 6 mm lang und 0,8 mm Durchmesser. Die Verbindung zwischen der Spitze und dem Griff konisch ist 4 mm lang. Darüber hinaus wird der Griff der Kryosonde mit einem Kunststoffrohr und das Klebeband zu Erfrierungen der Finger zu vermeiden, während das Werkzeug während des Verfahrens isoliert werden. </li><li> Andere Materialien, die für die Kryochirurgie benötigt werden, sind ein Stereomikroskop, scharfen Pinzetten, Mikro Sezieren Frühjahr Schere und ein Kunststoff-Transferpipette. Darüber hinaus bereiten einen Becher für die Fische betäuben und einen Plastiklöffel für die Übertragung der Fische. </li><li> Während der Operation werden die Fische auf einem feuchten Schwamm mit seiner Bauchseite nach oben (Abbildung 1B) platziert. Um das Tier in einer stabilen Verfahren halten, eineentsprechende Nut sollte manuell im Schwamm geschnitten werden. </li><li> Bereiten Sie einen Tank mit Wasser System, um die Fische nach der Operation zu übertragen. </li><li> Richten Sie eine Doppel-Timer zuerst mit einem 10 Sekunden-Countdown und dann automatisch eine 24 Sekunden-Countdown. </li></ol> 2. Die Vorgehensweise Cryoinjury <ol><li> Abkühlen lassen Kryosonde durch Eintauchen der Spitze in 3-5 cm von flüssigem Stickstoff für mindestens 3 min. </li><li> Anesthetize einen erwachsenen Zebrafisch durch Eintauchen in 0,02% Tricain, bis der Fisch dreht sich auf den Rücken und seine Kiemen fast nicht mehr bewegen (ca. 90 Sekunden). </li><li> Übertragen Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel an einem feuchten Schwamm, das ausgeschnitten wurde, einen Fisch auf den Kopf zu halten (Abbildung 1B). Halten Fisch stetig mit einer Pinzette mit nicht-dominanten Hand. Optisch suchen Sie den hinteren medialen Rand des Herzens und nutzen gerade Iridektomie Schere, um die Haut durchstechen. (1C). </li><li> Machen Sie eine kleine (ca. 2 mm) Einschnitt oberhalb des Herzens durch Cutting geradeaus nach vorne durch die Haut, Muskeln (1D). Nicht durch den knöchernen Kiemen-Apparat schneiden, da dies das Tier zu töten. </li><li> Sanft reißen die silbrig Epithelschicht der Unterhaut (1E) mit der Spitze der Schere, um einen direkten Zugang zu dem schlagenden Ventrikel haben. Setzen Sie die Schere tiefer in die Körperhöhle, da dies das Herz durchstechen. Das schlagende Herz sollte gut sichtbar sein, und keine umfangreichen Blutungen sollten während der Thorakotomie (1F) auftreten. </li><li> Starten Sie die programmierte Timer, der für 10 Sekunden von 24 Sekunden folgte eingestellt wurde. Während 10 Sekunden nehmen Sie die Kryosonde aus dem flüssigen Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass es keine mehr Stickstoff auf der Kryosonde durch Schütteln Sie sie vorsichtig. Verbreiten Sie die Schnitt seitlich mit einer Pinzette, um die Brust (1F) zu öffnen. </li><li> Wenn der Timer klingelt 10 Sekunden, sofort, aber vorsichtig, berühren Sie die Ventrikel mit der Spitze des PRE-gekühlten Kryosonde (1G). </li><li> Wenn der Timer klingelt 24 Sekunden, gießen Sie 2-3 ml Wasser-System mit einem Kunststoff-Pipette auf die Brust, um die Kryosonde aus dem Gewebe zu lösen, und überweisen Sie den Fisch in den Tank mit Wasser System. </li><li> Die Fische sollten Atmung nach einigen Sekunden neu zu starten, und dann sollte es wieder schwimmen. Wenn es nicht nach rund 45 Sekunden nicht atmen, regen die Tiere durch spritzen Wasser in die Kiemen mit einer Kunststoff-Pipette, bis es von selbst atmen beginnt. Nach unserer Erfahrung überleben 95% der Fische Chirurgie, und alle Todesfälle ereignen sich am Tag der Operation. Es wird nicht notwendig sein, um Einschnitte zu vernähen. </li></ol> 3. Herz-Sammlung und Fixation <ol><li> Bereiten Sie 1 mL 2% Formalin in einem Mikrozentrifugenröhrchen für die Festsetzung des Herzens, zwei Pinzetten, Mikro-Dissektion und die feuchten Schwamm geschlitzt. </li><li> Am Tag nach cryoinjury ausgewählt, einschläfern den Fisch in 0,1% Tricain für 5 Minuten. </li><li> Legen Sie dieFisch Bauchseite bis in eine feuchte, geschlitzte Schwamm. Machen Sie einen großen (ca. 4 mm) Einschnitt oberhalb des Herzens durch die Kiemen-Knorpel mit den Mikro-Dissektion. Öffnen Sie weit den Einschnitt mit einer Pinzette (Abbildung 1H). </li><li> Kneifen Sie von den Bulbus arteriosus, eine weiße Struktur ventral des Ventrikels (Abbildung 1 HALLO), und entfernen Sie das Herz aus dem Hohlraum, indem Sie es. Eine ganze seziert Herzen ist in 1J und 2A gezeigt. </li><li> Legen Sie bis zu 3 Herzen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 2% Formalin. Drehen Sie das Rohr mehrmals und halten Sie sie über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 4. Herz-Montage <ol><li> Spülen Sie die Herzen in PBS für 5 Minuten. Übertragen Sie die Herzen in 10 ml 30% Saccharose, das sollte bei 4 ° C vorgekühlt werden, und vorsichtig mischen. Die Probe sollte zunächst an der Oberfläche der Saccharose-Lösung zu schweben. Weiter Inkubation für 1 Stunde 20 Minuten bei 4 ° C. Nachdieses Mal wird die Herzen der Boden des Röhrchens zu versenken. </li><li> Bereiten Sie eine Box mit Trockeneis. Nehmen Sie eine Einbettform, und gießen Sie einen 5 mm dicken Oktober Eindeckmedium am unteren Rand der Form. </li><li> Mit einer Pinzette Stellen Sie das Herz in die OC T Eindeckmedium in der Form. Unter dem Stereomikroskop Einstellung der Orientierung der Probe, um die ventrikulären Apex an der Unterseite der Form und den Bulbus arteriosus nach oben zu erreichen. </li><li> Legen Sie die Formen mit Probe auf Trockeneis. Wenn das Eindeckmedium zu frieren beginnt, füllen Sie den Rest der Form mit OCT-Medium und lassen Sie es vollständig einfrieren. Halten Sie die Form für mindestens 1 h bei -80 ° C vor dem Schneiden. Die gefrorene Probe kann für viele Monate bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> 5. Herz-Schnitte <ol><li> Einrichten eines Kryostaten mit einem Schneidwerkzeug eine Größe von 16 um eine Kammer Temperatur von -24 ° C und die Temperatur der Probe bei -22 ° C </li><li> Setzen Sie den gefrorenen Block mit derMuster in den Kryostaten und fixieren die Ausrichtung mit dem Schneiden beginnen parallel zu der Unterseite des Blocks. </li><li> Bereiten Sie sechs Superfrost-plus Objektträger pro Block ein und rechnen können sie 1 bis 6. Fang an zu schneiden, bis das Gewebe erreicht wird, und schneiden Sie den Block um die Probe mit einer Rasierklinge. </li><li> Um 6 zu erhalten repliziert eines Herzens, nimm den ersten Abschnitt auf Folie 1, der zweite Abschnitt auf Folie 2, der dritte auf Folie 3, usw. Sobald Sie legte den sechsten Abschnitt auf Folie 6, mit Folie 1 starten und weiterfahren bis die ganze Organ wird geschnitten. Sammeln Sie zwei Reihen von rund 8 Sektionen auf der Folie (Abbildung 3). </li><li> Lassen Sie die Folien trocken für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bewahren Sie sie für bis zu 1 Jahr in gut verschlossenen Boxen bei -20 ° C </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Vertreter Herzschädigung nach diesem Protokoll ist in seziert ganzem Herzen bei 4 DPCI gezeigt (Tage nach cryoinjury; Abbildung 2D-F). Zu visualize die Myokardgewebe in vivo, verwendeten wir transgene Fische EGFP und nukleare DsRed2 unter der Kontrolle von herz-spezifische GMLC-2-Promotor 11,12. Das Fehlen von EGFP und DsRed2 Fluoreszenzsignale abgegrenzt einen scheibenförmigen Infarktzone entlang der apikal-lateralen Ventrikelwand. Um zelluläre und molekulare Analysen des Gewebes führen, waren die Herzen fester und mit einem Kryostaten geschnitten. Ein Vertreter Rutsche mit einer konsekutiven Serie von transversalen Herz Abschnitten wird in Abbildung 3 dargestellt. Die Abschnitte können mit verschiedenen Verfahren (4) analysiert werden. Um das Ausmaß der Herzregeneration gegenüber Narbenbildung bestimmen, führten wir histologische Analyse unter Verwendung Säurefuchsin Orange-G (AFOG)-Färbung, die unterschiedlich markiert Herz und fibrotischen Gewebe 9. Die Genexpressionsanalysen wurden nach der in situ Hybridisierung Verfahren erreicht <sup&gt; 13. Um die Verteilung der Marker-Proteine ​​nachzuweisen, verwendeten wir Immunfluoreszenztest mit spezifischen Antikörpern 9. Eine Kombination aus verschiedenen Färbeverfahren führt zur Identifizierung von molekularen und zellulären Mechanismen der kardialen Regeneration folgenden cryoinjury beteiligt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> 1. Induktion cryoinjury des Ventrikels im erwachsenen Zebrafisch. (A) Ein Foto von der Kryosonde. (B) Ein Erwachsener Zebrafisch ist in dem Schlitz des Schwamms mit seinem vorderen Seite nach oben angeordnet. (CF) Brusteinschnitt, um das Herz zugreifen. (C) ein kleiner Schnitt durch die Haut und Muskeln zwischen den beiden Brustflossen (rote Linie). (D) Die Schere ist in den Einschnitt eingeführt, um die Haut nach dem roten Pfeil geschnitten. (E) unter die Haut, wird die feine Schicht aus silbrig Unterhaut (umgeben von blau gestrichelte Linie) vorsichtig geöffnet, um das Herz zugreifen. (F) Der Schnitt wird mit der VerbreitungZangen und das pulsierende Herzkammer (grüner Pfeil) ist zugänglich für cryoinjury. (G) Das kalte Kryosonde wird sanft in die Brust, das Herz zu berühren eingefügt. (HJ) Herz-Sammlung. (H) einer tiefen und langen Schnitt wird durch die Kiemenbogen der Brust gemacht, um die Perikardhöhle zugreifen. Zwei Herzen Strukturen sind sichtbar: Bulbus arteriosus (weißer Pfeil) und Ventrikel (grüner Pfeil). (I) Der Bulbus arteriosus ist mit einer Zange halten und zog aus der Körperhöhle. (J) Die gesamte Herz aus des Körpers ausgeschnitten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter-Steuerung und cryoinjured Herzen von erwachsenen transgenen Zebrafisch-EGFP und nukleare DsRed2 in Kardiomyozyten seziert. (AC) unverletzt Herz. (A) Die Dunkelfeld-Beleuchtung zeigt den Ventrikel (V), Bulbus arteriosus (Ba, weiß) und die Ventile (Va), wo das Atrium zum Ventrikel verbunden war. (B und C) Fluoreszenzbilder von t<html> er intakt Ventrikel-Display und EGFP-Expression in Kardiomyozyten DsRed2. (DF) Herz an der 4 Tage nach cryoinjury (4 DPCI) (D) Die Dunkelfeldbeleuchtung zeigt einen scheibenförmigen Infarkt (gelb gestrichelte Linie). (EF) Cardiomyocyte Marker EGFP und DsRed2 sind nicht im Infarktbereich nachgewiesen, was auf die beschädigte Myokard (eingekreist durch die gestrichelte Linie). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> 3. Schneiden des Herzens. (A) insgesamt Herzen mit der Zeichnung von Querschnitten von unten des Herzens (1 und 2, rot) in Richtung der Oberseite des Herzens (3 und 4 in grün). (B) Fotografie von einem Objektträger mit der Reihe von aufeinanderfolgenden Querschnitten mit AFOG (Säurefuchsin Orange-G) gefärbt. Die ersten Abschnitte (1 und 2, rote Quadrate) enthalten die Herzspitze, und die letzten Abschnitte des Herzens (3 und 4, grüne Quadrate) umfassen Bulbus arteriosus. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; 4. Beispiele der Analyse auf Herz Abschnitte 7 Tage nach cryoinjury durchgeführt. (A) AFOG (Säurefuchsin Orange-G) Färbung Etiketten gesunde Muskelzellen in orange, das Narbengewebe mit Kollagen und Fibrin in blau in rot. (B) In situ-Hybridisierung von ventrikulären Myosin schwere Kette (vmhc) mRNA visualisiert das intakte Myokard (Blau-Färbung). Das verletzte Gewebe ist frei von der kardialen Gentranskript (rot gestrichelte Linie). (C) Immunoassaying von Tropomyosin (grün) beschriftet intakten Herzmuskelzellen und nicht geschädigtem Gewebe (umkreist mit der gestrichelten Linie). DAPI (blau) färbt die Kerne aller Zellen. (D) genetisch markierten Herzmuskelzellen Express DsRed2 (rot) in den Kernen. DAPI (blau) markiert alle Kerne. Die Infarktzone enthält keine DsRed2-positiven Zellen (weiße gestrichelte Linie).

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Experimentelle Untersuchungen an Tieren wurde von der kantonalen Veterinäramt Freiburg genehmigt worden.

Cryoinjury wird als kontrollierte Beschädigung des Gewebes durch die präzise Anwendung extremer Kälte 14 definiert. Direkt thermischen Schock zerstört die Zellen durch Proteine ​​zu zerstören und intrazellulärer Flüssigkeit die Bildung von Eiskristallen, die die Plasmamembran zerreißt. Als Folge sterben die verletzten Zellen in den Verfahren der Apoptose und Nekrose 14. Beide Zelltodmechanismen Es ist gezeigt worden, um Gewebe Verlust nach Myokardinfarkt 15 beitragen. Somit stellt cryoinjury ein geeignetes Modell zur Induktion einer Herzinfarkt. Mehrere Studien berichteten auch diese Methode erwies sich in verschiedenen Säugetieren, darunter Mäuse, Ratten, Kaninchen und Schweine 6,7. Die Anpassung des cryoinjury Protokoll im Zebrafisch ermöglicht eine vergleichende Diskussion über den Infarkt Reaktion zwischen verschiedenen Spezies. Zwei weitere Gruppen, die unabhängig die cryoinjury Verfahren für die erwachsenen Zebrafisch Herz entwickelt. Die Hauptunterschiede sind die surgery Verfahren, die Art der Instrumente und angewendet Gefrierzeit. In der Studie von González-Rosa et al. Wurde der Herzbeutel durch Zerreißen des Gewebes statt Schneiden eröffnet. Sie verwendeten 0,3 mm Kupfer Filament in Verbindung mit einem Polyamid Rohr in flüssigem Stickstoff, um das Herz für einige Sekunden, bis Auftauen könnte 10 beobachtet wird, einzufrieren vorgekühlt. In der Studie von Schnabel et al., Eine konische Stück Trockeneis von 20 mm Länge mit einer spitz zulaufenden Spitze von 2 mm im Durchmesser wurde verwendet, um das Herz für 10 Sekunden 8 zu berühren. Die beiden Gruppen erhalten ventrikulären Schäden durch den Tod des Herzmuskels. Der Vorteil unserer Methode ist eine besser reproduzierbare Ablagerung von Kollagen-reiche Narbe, die besser imitiert die frühen Infarkt heilende Reaktionen in Säugetier-Systemen beobachtet. Die entscheidender Schritt bei der cryoinjury Verfahren Zebrafisch ist ein Einschnitt durch die Haut und den Herzbeutel ohne Durchstechen der zugrunde liegenden Herzens. Ein richtig performed Chirurgie verursacht wenig Blutungen. Profuse Blutung weist auf eine unbeabsichtigte Punktion des Ventrikels mit der Schere. In solchen Fällen sollten die Tiere aus dem Experiment zurückgezogen werden. Um zu vermeiden, Punktieren des Herzens, sollte der Punkt der Schere in einem flachen Winkel auf die Haut gerichtet sein. Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Erstellung einer reproduzierbare Verletzung ist die genaue Positionierung des kalten Kryosonde auf den Ventrikel für die optimale genaue Dauer. Zu kurz Einfrieren Zeit wird bei der Entzündung mit wenig Zelltod führen. Längere Einfrieren, auf der anderen Seite kann erheblichen Schaden anrichten des Herzens, die eine verstärkte Mortalität der Tiere führen kann. Wir stellten fest, dass der optimale Zeitpunkt, um das Ventrikel in den gefrorenen Zustand im Bereich zwischen 23 bis 26 Sekunden lang für eine 2 cm lang erwachsenen Zebrafisch, und es kann abhängig von der Größe unterscheiden der Tiere. Weil unser Protokoll ist sehr einfach und schnell, gibt es keinen experimentellen Grenzeations in unterwerfen ausreichende Anzahl von Tieren, um eine angemessene biologische Replikationen zu erhalten. Das kryochirurgische Behandlung wird sehr gut von den Tieren gut vertragen. Sammlung der Herzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach cryoinjury ermöglicht detaillierte Charakterisierung der nachfolgenden Phasen während des regenerativen Prozess. Die experimentelle Analyse der cryoinjured Herzen können gehören: 1) Darstellung der Gentranskription durch in situ Hybridisierung, 2) Detektion von Protein Verteilung durch Immunfluoreszenzfärbung, 3) histologischen Bildgebung mit unterschiedlichen Strukturen. Das Verständnis der Schlüssel Heilungsprozesse nach einem Herzinfarkt im Zebrafisch wird Auswirkungen auf den Bereich der Regenerativen Biologie. Darüber hinaus könnte es von Vorteil sein für die Gestaltung neuer therapeutischer Ansätze in der regenerativen Medizin.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Micro Sezieren Frühjahr Schere </td><td> Chirurgische Roboz Instrument Co., Inc. </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Formaldehyd ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT-Verbindung </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Slides Superfrost Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way Einweg Einbettschälchen - Verkürzte Formen T8 </td><td> Polyscience, Inc. </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

Das Säugetier-Herzens in der Lage ist signifikante Regeneration nach einer akuten Verletzung wie Myokardinfarkt 1. Im Gegensatz dazu behalten urodele Amphibien und Knochenfische eine bemerkenswerte Fähigkeit zur kardialen Regeneration mit wenig oder ohne Narbenbildung während des gesamten Lebens 2,3. Es ist nicht bekannt, warum nur einige Nicht-Säugetier-Wirbeltiere können eine komplette Orgel aus dem Rest Gewebe 4,5 neu zu erstellen. Um die molekularen und zellulären Unterschiede zwischen regenerativen Reaktionen in verschiedenen Spezies zu verstehen, müssen wir ähnliche Ansätze zur Induktion von akuten Verletzungen verwenden. Bei Säugetieren ist das am häufigsten verwendete Modell zur Herzwiederherstellung Studie akute Ischämie nach einer Ligatur der Koronararterie oder Zerstörung von Gewebe nach cryoinjury 6,7. Die kardialen Regeneration im Zebrafisch Molche und wurde überwiegend nach einer Teilresektion des ventrikulären Apex 2,3 untersucht. In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen establIshed die cryoinjury Technik bei erwachsenen Zebrafisch 10.08. Diese Methode hat ein großes Potenzial, weil es eine vergleichende Diskussion der Ergebnisse aus den Säugetier-und Nicht-Säugetier-Spezies erhalten werden können. Hier präsentieren wir eine Methode, um eine reproduzierbare scheibenförmigen Infarkt des Zebrafisch Ventrikels durch cryoinjury induzieren. Diese Verletzung Modell basiert auf schnelle Gefrier-Tau-Gewebe, das in massiver Zelltod von etwa 20% der Kardiomyozyten der Ventrikelwand Ergebnissen. Zuerst wurde ein kleiner Einschnitt in die Brust mit Iridektomie Scheren, um die Herzen zu übersetzen. Die Ventrikelwand wurde direkt durch die Anwendung für 23-25 ​​Sekunden ein Edelstahl Kryosonde in flüssigem Stickstoff eingefroren vorgekühlt. Um das Einfrieren des Herzens, der Fisch Wasser bei Raumtemperatur zu stoppen war an der Spitze der Kryosonde gesunken. Das Verfahren wird auch von den Tieren vertragen, mit einer Überlebensrate von 95%. Um den Regenerationsprozess zu charakterisieren, wurden die Herzengesammelt und an verschiedenen Tagen nach cryoinjury befestigt. Anschließend wurden die Proben für Kryoschneiden eingebettet. Die Folien mit Schnitte wurden für die histologische Analyse verarbeitet werden, in-situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Das Unternehmen erweitert unser Verständnis der Faktoren, die für die regenerative Plastizität im Zebrafisch benötigt werden, und liefern neue Einblicke in die Maschinerie der kardialen Regeneration. Ein konzeptionelles Verständnis der molekularen und Herz Regeneration im Zebrafisch wird Auswirkungen sowohl der Entwicklungsbiologie und der regenerativen Medizin.

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Zebrafisch stellt ein wertvolles Modell, um die Mechanismen von Herz-Regeneration bei Wirbeltieren zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion eines Herzinfarktes bei erwachsenen Zebrafisch mit cryoinjury. Dieses Verfahren führt zu einer massiven Zelltod innerhalb von 20% der Ventrikelwand, ähnlich der in Säugetieren Infarkten beobachtet.

Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Aufrufe.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Zebrafisch stellt ein wertvolles Modell, um die Mechanismen von Herz-Regeneration bei Wirbeltieren zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion eines Herzinfarktes bei erwachsenen Zebrafisch mit cryoinjury. Dieses Verfahren führt zu einer massiven Zelltod innerhalb von 20% der Ventrikelwand, ähnlich der in Säugetieren Infarkten beobachtet.

Serie: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Forschung

Medizin

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Primärer Ergebnisbeurteilung in einem Schwein Modell eines akuten Myokardinfarkts

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Myokardinfarkts bei neugeborenen Mäusen, ein Modell von Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Echtzeit-Druck-Volumen-Analyse eines akuten Myokardinfarkts bei Mäusen

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...