Wir danken Jakob Viel für seine hilfreichen Kommentare und Vorschläge. Wir danken auch Anne de Jong für seine Hilfe bei der Analyse der Bioinformatik. Yanglei Yi und Zhibo Li werden von der China Scholarship Council (CSC) unterstützt. Wir bedanken uns bei NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) für ihre finanzielle Unterstützung auf OPK.

(1) keimenden Kartoffel unter sterilen Bedingungen
<ol><li>Spülen Sie die Kartoffel-Oberfläche mit sterilem Wasser. Baden Sie die Kartoffel in 70 % igem Ethanol und dann in 3 % Natriumhypochlorit für 5 min. Spülen Sie ihn wieder mit sterilem Wasser, alle übrigen Natriumhypochlorit zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Materialien für das Keimen und wachsen Kartoffelknollen benötigt; die Kunststoff-Töpfe, Engraftment Körbe, Vermiculit, sterilisieren und wässern durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Materialien autoklavierbar sind. Andernfalls verwenden Sie andere Sterilisation Methoden.</li>
	<li>Setzen Sie die Oberfläche sterilisiert Kartoffel in den Engraftment Korb, und platzieren Sie diese in einem Autoklaven Pot mit nassen Vermiculit.</li>
	<li>Halten Sie den Topf in einer Klimakammer bei 24 ° C für drei Wochen. Setzen Sie ihn auf Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1) und 8 Stunden der Dunkelheit. Um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie ein großes Glasfaser Feld um den Pot zu decken.</li>
</ol>2. Sammeln von Kartoffel Wurzelausscheidungen
<ol><li>Wenn die Triebe sprießen, Transfer der Korb mit die ganze Kartoffel in einen sterilen Becher mit 150 mL autoklaviert deionisiertes Wasser gefüllt, mit der Kartoffel Knollen platziert oberhalb der Wasseroberfläche und die Wurzeln in das Wasser getaucht (siehe Abbildung 1). Halten Sie den Keimling in der Klimakammer, und verwenden Sie dieselben Einstellungen wie zuvor [24 ° C; Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1), 8 h der Finsternis].</li>
	<li>Ab dem zweiten Tag auf sammeln Sie das Wasser mit den Ausscheidungen und Nachfüllen Sie den Becher mit sterilem deionisiertes Wasser. Führen Sie die Probenahme jeden Tag bis zum siebten Tag nach der Übertragung des Keimlings.</li>
	<li>Jede Probe separat bei 4 ° c Lagern Für jede Probe verteilt 100 µL auf ein Luria-Bertani (LB; 1 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) nährbodenplatte für mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.</li>
	<li>Kombinieren Sie die gesammelten Proben von einem Sämling, und durch Gefriertrocknung sie bei-40 ° C zu einem Endvolumen von 150 mL zu konzentrieren.</li>
</ol>(3) wachsenden Bakterien
<ol><li>Streifen Sie eine B. Mycoides Belastung aus einem-80 ° C Glycerin bestand auf eine LB-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C über Nacht.</li>
	<li>Impfen Sie eine LB-Flüssigmedium mit eine einzige Kolonie von der Platte zu, und wachsen Sie die Kultur in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min über Nacht bei 30 ° C.</li>
</ol>4. Behandlung und Beprobung von Bakterien
<ol><li>Um die Wachstumskurve der Bakterien mit Wurzelausscheidungen behandelt, um eine Negativkontrolle zu vergleichen, bereiten Sie eine Reihe von Flaschen mit 50 mL LB-Flüssigmedium. Alle Flaschen 0,5 mL die Übernachtung Bakterienkultur hinzu, und fügen Sie 0 %, 5 %, 10 % oder 15 % (V/V) Wurzel Exsudat oder sterilen deionisiertes Wasser bzw. auf das Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kultur mit entionisiertem Wasser anstelle von Wurzelausscheidungen als Kontrolle. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) jeweils 1 h danach. Generieren einer Wachstumskurs von Plotten die OD600 Werte im Vergleich zur Zeit. Hinweis: Wir haben gesehen, dass 10 % der die Wurzelausscheidungen keinen Einfluss auf das Wachstum von B. Mycoides (siehe Abbildung 2). Dieses Verhältnis wurde für RNA-Seq Experimente verwendet.</li>
	<li>Verdünnen Sie eine Übernachtung B. Mycoides -Kultur mit 90 mL vorgewärmten LB-Medium auf die anfängliche OD600 von ~ 0,05 in eine 300 mL Flasche. Die Kultur 10 mL Wurzelausscheidungen hinzu und bei 30 ° C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 10 mL sterilem deionisiertes Wasserbehandlung als Kontrolle. Sammeln Sie Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 2 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und sofort das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann bis zur Verwendung bei-80 ° C lagern.</li>
</ol>(5) RNA-Isolation
Hinweis: Bevor Sie beginnen die Isolation, bereiten Sie die Werkbank, Racks und Pipetten mit einer RNase Dekontaminationslösung reinigt (siehe Tabelle der Materialien). Tragen Sie Handschuhe bei aller Zeiten, und sicherstellen, dass alle Rohre, Tipps und Lösungen sind RNase-freie. Halten Sie die Proben auf Eis wenn möglich.
<ol><li>Reinstwasser (100 µL DEPC pro 100 mL Lösung) 0,1 % (V/V) von Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC) hinzufügen, gut vermischen und über Nacht bei Zimmertemperatur aufbewahren. Autoklaven die Mischung, die DEPC nach Behandlung über Nacht zu inaktivieren. Diese DEPC-behandeltem Reinstwasser zur Vorbereitung der TE-Puffer verwenden [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] und einer 10 % igen SDS (w/V) Lösung.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets auf dem Eis Auftauen und jeweils in 400 µL TE (DEPC) Puffer auszusetzen. Übertragen Sie die Suspensionen in 2 mL Schraubverschluss Rohre.</li>
	<li>Premix 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1 V/V) und 300 µL Phenol (saure Phenol, RNA-Klasse), und die Mischung für 5 min stehen lassen. Nehmen Sie 500 µL der oberen organischen Phase die resuspendierte Zellen hinzu. Dann fügen Sie 50 µL 10 % SDS und 0,5 g Glasperlen (0,5 µm) in die Röhre.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel fest und legen Sie das Rohr in eine Rührwerksmühle Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine 3 × 45 s Puls Homogenisierung mit einem Intervall von 1 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 11.000 x g (4 ° C) und übertragen Sie die obere Phase auf einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Die obere Phase ab Schritt 5.5 500 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) hinzu und Zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 11.000 x g (4 ° C). Hinweis: Die folgenden Schritte wurden geändert von Anweisungen des Herstellers eine kommerzielle Glasfaser filterbasierte RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Übertragen Sie 500 µL der oberen Phase auf einem frischen Rohr, fügen Sie 2 Bände (1 mL) eines Puffers Lyse/Bindung hinzu und mischen Sie es durch pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Filter und Sammlung Röhrchen (aus dem RNA-Isolierung-Kit) und pipette die Mischung aus Schritt 5.7 mit dem Filter-Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µL DNase Puffer, 10 µL der DNase I und 5 µL RNase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie die fertige Lösung mischen auf dem Filter der Filter-Röhre, und 20-30 Minuten bei 15-25 ° c inkubieren</li>
	<li>Der Wasch-Schritte nach Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 50 µL eines Puffers Elution, um die RNA zu eluieren.</li>
	<li>Speichern der eluierten RNS bei-80 ° C und einen Kunststoff Paraffin Film um ihn herum. Zum gleichen Zeitpunkt übertragen Sie wenige Mikroliter der Probe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einen Qualitäts-Check durchführen.</li>
</ol>(6) RNA-Qualitäts-Check und Sequenzierung
<ol><li>Überprüfen Sie die RNA mit einem Microvolume Spektrophotometer. Hinweis: Extinktion Verhältnisse bei 260/280 sollte über 1,8 und Kennzahlen auf 260/230 sollte über mindestens 1,8, vorzugsweise über 2.0.</li>
	<li>Lauf die gereinigte RNA in automatisierte Elektrophorese Instrument mit der empfehlen-RNA-Analyse kit (siehe Tabelle der Materialien); die RNA-Integrität-Anzahl (RIN) muss mindestens über 7 um fortzufahren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Gesamtbetrag von 3 µg RNA pro Probe, um Bibliotheken mit einer RNA-Seq-Bibliothek-Vorbereitung zu generieren kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Empfehlungen des Herstellers. Hinweis: Die Bibliothek Vorbereitungen wurden auf einer Plattform von Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert und gepaart Ende liest generiert wurden.</li>
</ol>(7) Datenanalyse mit Hilfe den Web-basierten Pipeline T-REx
<ol><li>Führen Sie eine Qualität Filterung mit dem FASTX-Toolkit Version 0.0.13 (Phred Qualitätsfaktoren von > 20). Schneiden Sie die rohen RNA-Seq liest aus dem Adapter-Sequenzen mit dem Trimmomatic-Werkzeug. Hinweis: Die nachfolgenden Analysen beruhten auf saubere Daten mit hoher Qualität.</li>
	<li>Laden Sie die B. Mycoides ATCC 6462 NCBI-Genom-Datenbank (NCBI Beitritt Nr.: CP009692.1) und verwenden Sie es als eine Referenz-Genom für die Zuordnung der sauberen liest mit Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Verwendung HTSeq v0.6.1 liest Zahlen zählen, jedes Gen zugeordnet und die Lesevorgänge pro Kilobase Abschrift pro million zugeordneten liest (RPKM) jedes Gens basierend auf der Länge der Anzahl der Gene und liest dieses Gen zugeordnet.</li>
	<li>Für die Analyse der Daten von der T-REx-Pipeline, verwenden Sie die RPKM-Tabelle als Eingabe sowie drei beschreibenden Dateien: (i) eine Datei Faktoren zu beschreiben, das Experiment in Faktoren, (Ii) eine Kontraste-Datei zu definieren, welche Faktoren für differenzielle Genexpression verglichen werden , und (Iii) eine Klassendatei um Gruppen von Genen von Interesse zu beschreiben. Hinweis: Die beschreibenden Dateien sind in.txt Format. Beispiele finden Sie auf der Webseite von T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Eine detaillierte Anleitung für die Datenanalyse mit T-REx finden Sie in einer früheren Publikation von de Jong Et al. 14.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Pflanze-Mikroben-Interaktionen haben vermutet, um durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pflanzen bestimmt werden. Solche Interaktionen sind sehr komplex und schwierig zu studieren in ein natürliches System, umfasst verschiedene Mikrobenarten, potenziell als Konsortien. Dieses Whitepaper beschreibt ein vereinfachtes Protokoll, um die bakterielle Reaktion auf Wurzelausscheidungen unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Das Transkriptom-Profil des standarddüngung, bei Kontakt mit Wurzelau...

Pflanzen können Exsudat bis zu 20 % des Kohlenstoffs in der Rhizosphäre1, d. h., die schmale Zone des Bodens in der Nähe der Wurzeln während der Photosynthese durch Wurzeln fixiert. Durch die höhere nährstoffverfügbarkeit ist die Rhizosphäre einen geeigneten Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums Bakterien. Die Wurzelausscheidungen enthalten eine Reihe von anorganischen Verbindungen wie Ionen, anorganische Säuren, Sauerstoff und Wasser. Jedoch wird der Großteil der Wurzelausscheidungen von organischen Materialien, gebildet, in niedermolekulare Verbindungen und hochmolekularen Verbindungen unterteilt werden kann. Die niedermolekularen Verbindungen enthalten Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Phenolverbindungen, Fettsäuren und eine Reihe von sekundären Pflanzenstoffen. Die hochmolekularen Verbindungen bestehen aus Schleim und Proteine,2,3. Rhizosphäre Mikroorganismen können einige dieser Verbindungen als Energiequelle für Wachstum und Entwicklung. Die Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Wurzelbakterien Gemeinschaft, da die Pflanze produziert Verbindungen in die Exsudate durch Einwirkung auf die Expression bestimmter Gene das Verhalten der Rhizosphäre-assoziierte Bakterien beeinflussen können.
Verständnis der bakteriellen Antwort auf Wurzelausscheidungen ist ein wichtiger Schritt bei der Entschlüsselung wechselwirkungsmechanismen Pflanze-Mikroben. Da die bakterielle Reaktion auf Pflanze-Mikroben-Interaktionen das Produkt der differentiellen Genexpression, kann es durch die Transkriptom-Analyse untersucht werden. Mit dieser Methode, identifiziert frühere Studien mehrere wichtige Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. In Pseudomonas Aeruginosawurden Gene, die im Stoffwechsel, Chemotaxis und Typ II-Sekretion zur Beantwortung von Zuckerrüben Wurzel Exsudate4gezeigt. Ventilator Et Al. 5 studierte die transkriptomischen Profilierung der B. Amyloliquefaciens FZB42 als Reaktion auf Mais Wurzelausscheidungen. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die Gene, die stark durch die Wurzelausscheidungen induziert, Stoffwechselwege in Bezug auf Nährstoff Auslastung, Chemotaxis, Motilität und nicht-ribosomale Synthese von antimikrobiellen Peptiden und Polyketides mehrere Gruppen beteiligt sind.
Die Genauigkeit dieser Studien stützt sich auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen. Obwohl mehrere Methoden der Sammlung von Wurzelausscheidungen für verschiedene Zwecke beschrieben haben, entweder verlangen ausgeklügelte Instrumente oder sind nicht in kontrollierten Bedingungen6,7,8durchgeführt. Darüber hinaus können Hemmung der Rhizosphäre Mikroorganismen Wurzel Exsudat Zusammensetzung beeinflussen, indem Pflanze Zellmembran Durchlässigkeit beeinträchtigen und schädigen die Wurzel Gewebe, insbesondere im Falle von Konsortien von Mikroorganismen9. Bei der Untersuchung der mikrobiellen auf Wurzelausscheidungen ist es wichtig, genau definierte Bedingungen zu verwenden, um Veränderung der Verbindungen durch andere Mikroorganismen10zu vermeiden. Darüber hinaus ist qualitativ hochwertige RNA erforderlich für RNA-Seq Transkriptom-Studien. Jedoch haben beim Umgang mit nicht-Modell-bakterielle Belastungen, die standard-Protokolle oder kommerziellen Kits in der Regel eine geringe Effizienz durch unbekannte Faktoren oder spezielle Wachstumseigenschaften.
Das hier beschriebene Protokoll wurde mit B. Mycoides, das ist ein grampositives, Spore bildet Bakterium Firmicute Phylum überprüft. Es ist allgegenwärtig in der Rhizosphäre der verschiedenen Pflanzenarten. Für diese Spezies, einschließlich Induktion des systematischen Widerstandes (ISR) in Zuckerrüben11, Hemmung der Dämpfung-off-Erregers Pythium Gurke12sowie Stickstoff wurden mehrere Pflanze Förderung Wachstumseigenschaften gemeldet. Fixierung in der Sonnenblume Rhizosphäre13. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Interaktion mit einer Wirtspflanze nicht gut untersucht.
Das Ziel der hier vorgestellten Experimente ist es, die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert B. Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Kurzum, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: zunächst sammeln Kartoffeln Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie dann, qualitativ hochwertige RNA aus Bakterienzellen mit Wurzelausscheidungen behandelt. Der letzte Schritt ist die Analyse der Daten mithilfe der webbasierten T-REx Pipeline14. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B. Mycoides Gene zu identifizieren, die zeigen eine Verschiebung im Ausdruck Niveaus beim Kontakt mit Wurzelausscheidungen und damit möglicherweise eine wichtige Rolle in Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

<table><tbody><tr><td>sodium hypochlorite</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;CAS: 7681-52-9&amp;nbsp;</td><td>10-15%&amp;nbsp; active chlorine</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubater</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>2.0 ml tube with screw cap</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Bead mill homogenizer</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&amp;nbsp;</td><td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>phenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA grade</td></tr><tr><td>chloroform-isoamyl alcohol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td></tr><tr><td>High pure RNA isolation kit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Automated electrophoresis instrument</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Microvolume spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA quality analysis kit</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 Nano kit&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Directional RNA library Prep kit</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>For Illumina</td></tr></tbody></table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

Pflanze-assoziierte Bakterien spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung von Wachstum und Verhütung von Krankheiten bei Pflanzen. Die Anwendung der Pflanze wachstumsfördernde standarddüngung (PGPR) als biodüngemittel oder Biocontrol Mittel geworden eine effektive Alternative zu der Verwendung von herkömmlichen Düngemitteln und Ernte-Produktivität bei geringen Kosten zu erhöhen. Pflanze-Mikroben-Interaktionen abhängig Host Pflanze abgesondert Signale und eine Reaktion hereon durch ihre assoziierten Bakterien. Die molekularen Mechanismen der wie nützlichen Bakterien reagieren jedoch auf die damit verbundenen pflanzliche, dass Signale nicht vollständig verstanden sind. Beurteilung der transkriptomischen auf der Bakterien Wurzelausscheidungen ist ein leistungsfähiger Ansatz um die bakterielle Genexpression und Verordnung unter rhizospheric Bedingungen zu bestimmen. Solches Wissen ist notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu verstehen. Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll um die transkriptomischen Antwort von B. Mycoides EC18, ein Stamm von der Kartoffel Endosphere, Kartoffel Wurzelausscheidungen isoliert zu studieren. Mit Hilfe der jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung-Technologie kann dieses Protokoll in mehreren Wochen und produzieren massive Datasets durchgeführt werden. Zunächst sammeln wir die Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen, nach denen sie B. Mycoides Kulturen hinzugefügt werden. Die RNA aus diesen Kulturen ist isoliert mit einem Phenol/Chloroform-Methode kombiniert mit einem kommerziellen Kit und durch automatisierte Elektrophorese Instrument einer Qualitätskontrolle unterzogen. Nach der Sequenzierung, Datenanalyse erfolgt mit der Web-basierten T-REx-Pipeline und eine Gruppe von differentiell exprimierten Genen identifiziert. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um neue Entdeckungen auf die bakterielle Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu ermöglichen.

Pflanze-assoziierten Mikroorganismen können Wachstum und die Gesundheit positiv beeinflussen. Allerdings sind die Mechanismen die komplexen Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und ihre mikrobiellen Symbionten nicht vollständig geklärt. Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Wurzelbakterien Aktivität und Verhalten, und es wird in der Regel postuliert, dass die mikrobielle Besiedlung der Wurzeln mit dem Reiz der Mikroben zu Wurzelausscheidungen initiiert...

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Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.5K Aufrufe.  University of Groningen. Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Serie: Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Forschung

Umwelt

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has been developed and applied for various plant species including Nicotiana benthamiana, tomato, Arabidopsis, cotton, and monocot plants such as wheat and maize. Here, we describe a detailed protocol using PVX-based VbMS vectors to silence endogenous miRNAs in potato. To knock down the expression of a specific miRNA, target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are designed, integrated into plant virus vectors, and expressed in potato by Agrobacterium infiltration to bind directly to the endogenous miRNA of interest and block its function.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

We present a detailed protocol for potato virus X (PVX)-based microRNA silencing (VbMS) system to functionally characterize endogenous microRNAs (miRNAs) in potato. Target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are integrated into the PVX vector and transiently expressed in potato to silence the target miRNA or miRNA family.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Nachweis der Rhizobakterienbesiedlung auf Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Rhizobakterienbesiedlung an Pflanzenwurzeln für eine verbesserte mikrobielle Düngemitteleffizienz

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Immunologie und Infektion

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Biotechnik

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Biologie

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Zusammenfassung

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Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung