Name: oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch eine strategische Award vom Wellcome Trust für das Zentrum für Immunität, Infektion und Evolution (Http://ciie.bio.ed.ac.uk; Grant Referenz Nr. 095831) unterstützt. PFV wurde unterstützt durch eine Branco Weiss Fellowship (https://brancoweissfellowship.org/) und des Kanzlers Fellowship (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ wurde von einem NERC E3 DTP PhD Zugehörigkeit unterstützt.

1. pflegen Sie fliegen
<ol><li>Fliegen in 23 mL Kunststoff Ampullen mit 7 mL frisch zubereiteten Lewis Medium zu erhalten (geändert von Referenz-31; 1 L dreifach destilliert, H2O, 6,1 g Agar, 93,6 g Braunzucker, 68 g Mais, 18,7 g instant-Hefe, 15 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) in Inkubatoren bei 25 ± 1 ° C in 12 H:12 h hell: Dunkel-Zyklus mit ~ 60 % Luftfeuchtigkeit. Stecken Sie die Fläschchen mit nichtsaugenden Watte.</li>
	<li>Alle 14 Tage transfer 20 – 30 Erwachsene zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen mit instant, trockene Hefe hinzugefügt, um die Oberfläche für 2 – 3 Tage zur Eiablage um auftreten zu ermöglichen. Sicherzustellen Sie nach dieser Zeit, dass die Eier auf die Oberfläche der Lebensmittel sichtbar sind. Entfernen Sie die Erwachsene fliegen. Hinweis: Das hält fliegen in die Fläschchen als einzigen Generation, Alter abgestimmt Populationen.</li>
	<li>Lassen Sie die Eier zu entwickeln. Hinweis: Bei 25 ° C, Erwachsene fliegen Puppen an Tag 11 zu Eclose ab und fahren Sie über 12 – 14 Tage.</li>
</ol>2. bereiten Sie experimentelle fliegen
<ol><li>Sammeln Sie die Eier der Elterngeneration in einem Bevölkerung/Embryo-Kollektion-Käfig auf einer 75 mL Apfel-Agar-Platte (1 L dreifach destilliertem H2O, 30 g Agar, 33 g Saccharose, 330 mL Apfelsaft, 7 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) mit einem Hefe-Paste-Spread (Mischung Trockenhefe mit Erdnussbutter-ähnliche Konsistenz Wasser). Fügen Sie Wasser getränkten Wattebausch in den Käfig, Feuchtigkeit bieten. Hinweis: Um zu vermeiden, verwirrende Effekte durch Larven Aufzucht Dichteunterschiede, ist es wichtig, dass experimentelle fliegen in verschiedenen Fläschchen in ähnliche dichten aufgezogen werden. Die oben genannten Schritt wird durchgeführt, um zu vermeiden, verwirrende Effekte.</li>
	<li>24 h bei 25 ° C in einer 12 H:12 h inkubieren hell: Dunkel-Zyklus bis Eiablage stattgefunden hat. Wenn nach 24 Stunden gibt es zu wenige Eier, bieten Sie eine längere Gewöhnung. Ersetzen Sie Apple-Agarplatten und warten Sie Eiablage um für weitere 24 h auftreten.</li>
	<li>Ei-beladenen Apfel-Agarplatten aus dem Käfig der Bevölkerung zu nehmen. Entfernen Sie die restliche Hefe-Paste und keine Toten fliegen aus der Agar-Oberfläche.</li>
	<li>Tauchen Sie das Agar in 20 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und vertreiben Sie die Eier aus dem Apple-Agar mit einem feinen Pinsel sanft zu. Während in PBS angehalten, übertragen Sie die Eier auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und für 5 min lassen Sie, damit die Eier zu Boden sinken. Hinweis: Die meisten Eier befinden sich am äußeren Rand des Nährbodens.</li>
	<li>Nehmen Sie durch Abschneiden der unteren 4 mm eine gefilterte PIPETTENSPITZE p1000 und die PIPETTENSPITZE 1 mL der Lösung, genommen vom unteren Ende der 50 mL Zentrifugenröhrchen zu zeichnen. Auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen Sie und ermöglichen Sie es, sich niederzulassen. Hinweis: Wenn Sie Eier pipettieren, ist Snap-Freigabe der Kolben effizienter als eine sanfte Version.</li>
	<li>Entfernen Sie durch Abschneiden der unteren 4 mm eine gefilterte PIPETTENSPITZE p20. Legen Sie die Pipette auf eine gewünschte Lautstärke und vom unteren Rand der Microcentrifuge Schlauch ziehen. Hinweis: Mit der Praxis, ein Volumen von 5 µL enthält etwa 100 Eier.</li>
	<li>Verzichten Sie die gesammelten Eier auf das Essen und lassen sie für die erforderliche Menge an Zeit zu entwickeln.</li>
</ol>3. bakterielle Kultur
<ol><li>P. Entomophila und p. Aeruginosa Kulturen wachsen, impfen 10 mL Luria-Bertani (LB) Brühe mit 100 µL einer gefrorenen bakterielle Aktie bei 30 ° C (p. Entomophila) und 37 ° C (p. Aeruginosa), beziehungsweise. Schütteln Sie bei 150 u/min über Nacht. Sicherstellen Sie, dass die Bakterienkultur die Sättigung Phase erreicht.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Bakterien zur impfen der Flies in der exponentiellen Phase und schnell replizieren, die über Nacht Kultur in eine neue Subkultur, der eine gewünschte Lautstärke am nächsten Morgen impfen. Sicherstellen Sie, dass die Pre-Inokulum 10 % des Gesamtvolumens der Subkultur-Kultur. Hinweis: Oraler Infektion erfordert hohe. Es ist daher notwendig, ein beträchtliches Volumen der bakteriellen Kultur wachsen, so dass genügend Inokulation Kultur für die gewünschte Dosis und experimentelle Größe hergestellt werden kann. Berechnen, wieviel Subkultur benötigt wird, um die erforderliche infektiöse Dosen unter Verwendung der Gleichung MsVs = MichVich, wo M steht für eine Kultur der Extinktion gemessen bei 600 nm (OD600) Wert und V stellt seine Volumen. Tiefgestellte Buchstaben beziehen sich auf ob die Kultur als eine Subkultur (s) oder eine infektiöse Dosis (i) verwendet wird.</li>
	<li>Wachsen Sie diese Subkultur in einem 2 L konischen Kolben in einem Volumen, sodass der Subkultur Oberfläche (höchstens) nur über den Anfang der Küvette Hang fällt. Füllen Sie Sie nicht oberhalb dieser Marke, da es das Wachstum von Bakterien hemmen wird.</li>
	<li>Sicherzustellen Sie, dass die Bakterien in dieser Subkultur in der exponentiellen Wachstumsphase durch die Messung der OD alle 30 Minuten. Hinweis: Dies tritt nach 3 – 5 h, wo die Subkultur eine OD600 zwischen 0,6-0,8 erreicht.</li>
	<li>Gießen Sie gleiche Volumina dieser Subkultur über 50 mL Zentrifuge Röhren und Drehen der Subkultur bei 2.500 x g für 15 min bei 4 ° C, um die Bakterien zu Pellets. Sobald oelletiert, entfernen Sie und dann drehen Sie die überstand wieder auf die oben genannten Bedingungen für das Entfernen der großen Mehrheit der Bakterien zu bestätigen. Hinweis: Ein Pellet zu vernachlässigende Größe (kleiner als 1 mm in der Höhe) bestätigt dies.</li>
	<li>Kombinieren Sie die bakterielle Pellets der separaten Röhren durch aussetzen sie erneut in 5 mL Subkultur überstand und Rekombination dieser Lösungen in einem einzigen 50 mL-Tube. Drehen Sie diese konzentrierte Kultur bei 2.500 x g für 15 min bei 4 ° C, um die Bakterien zu Pellets.</li>
	<li>Entfernen Sie den überstand zu und wieder auszusetzen Sie das endgültige Bakterien Pellet in 5 % Saccharose-Wasser-Lösung. Die OD prüfen und Einstellen der gewünschten infektiöse Dosis (OD600 = 100 für p. Entomophila8 und OD600 = 25 für p. Aeruginosa16,28), durch erneute Aussetzung die Pellets in 5 % Saccharose-Wasser-Lösung um die gewünschte Lautstärke. Hinweis: Die Höhe von 5 % Saccharose-Wasser-Lösung hinzugefügt werden kann berechnet werden mit der Gleichung in Schritt 3.2.1 (MsVs = MichVich).</li>
</ol>(4) Oral infizieren fliegen
<ol><li>Um die oralen Infektion zu gewährleisten, verhungern Sie die fliegen für 2 – 4 h vor der Exposition gegenüber Bakterien durch die fliegen auf standard Agar Fläschchen (1 L dreifach destilliert H2O, 20 g Agar, 84 g Braunzucker, 7 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) zu übertragen.</li>
	<li>Bereiten Sie Infektion Fläschchen, während fliegen verhungert sein. Machen ein Pseudomonas -Infektion-Fläschchen durch pipettieren 500 µL standard Zucker Agar in den Deckel ein 7 mL Probenröhrchen und trocknen lassen. Legen Sie eine Disc Filterpapier im Deckel und 100 µL der bakteriellen Kultur direkt auf die Filterscheibe pipette. Ersetzen Sie für Kontrolle Infektionen die Bakterienkultur mit dem gleichen Volumen von 5 % Saccharose-Wasser-Lösung auf dem Filterpapier.</li>
	<li>Das Probenröhrchen einzelne fliegen hinzu und lassen Sie für 18 – 24 h.</li>
	<li>Oralen Infektion bestätigen, zuerst Oberfläche-sterilisieren die fliegen sofort nach der bakteriellen Belastung, indem man sie in 100 µL 70 % Ethanol für 20-30 s. entfernen das Ethanol und hinzufügen 100 µL dreifach destilliertes Wasser für 20-30 s vor das Wasser zu entfernen. Fügen Sie 100 µL 1 X PBS und homogenisieren Sie die Fliege zu.</li>
	<li>Das Homogenat auf der obersten Zeile einer 96-Well-Platte übertragen und alle weit unter 90 µL 1 X PBS hinzufügen.</li>
	<li>Verdünnen Sie seriell in diesem Beispiel um eine Reihe von KBE-Werte zu unterscheiden. Nehmen Sie 10 µL der Homogenat im oberen Brunnen und fügen Sie diese zu dem Brunnen unterhalb. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem zweiten gut, gut, 10 µL auf der Dritten übertragen und so weiter, für möglichst viele serielle Verdünnungen als erforderlich. Hinweis: Es ist wichtig, dass neue Pipettenspitzen für jeden Satz von Verdünnungen verwendet werden.</li>
	<li>Platte die serielle Verdünnungen auf einer LB Nähragar Platte in 5 µL Tröpfchen, um sicherzustellen, dass alle Tröpfchen diskret bleiben.</li>
	<li>Brüten Sie die LB-Agar-Platten über Nacht bei 30 ° C und 37 ° C für p. Entomophila und p. Aeruginosa, bzw. und zählen Sie sichtbar KBE. Hinweis: Während Drosophila Darm Mikroben verschiedene anaerobe Bedingungen erfordern, kann selektiven Medium, z. B. Pseudomonas isoliert Medium (PIM), verwendet werden, um sicherzustellen, dass nur Pseudomonas KBE gezählt werden.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der KBE pro Fliege durch zählen der Anzahl der Kolonien an die serielle Verdünnung wo 10 – 60 KBE deutlich sichtbar sind. Multiplizieren Sie dann mit den Verdünnungsfaktor anwesend, um die Anzahl der Bakterien pro Fliege berechnen.</li>
	<li>Durchzuführen Sie statistische Analysen. Wo nötig, verwandeln die KBE pro Flug nach einer Normalverteilung. Zu diesem Zweck Log-Transformation. Sobald umgewandelt, verallgemeinerte lineare Modelle (quantifizierten)30,31,32 zum Testen verwenden Sie wie die Behandlungsgruppen in KBE pro Fliege (mit handelsüblichen statistischen Software-Pakete wie R33) unterscheiden. Hinweis: Die verbleibenden fliegen Homogenat kann zur Messung der Genexpression durch quantitative reverse Transkription PCR (RT-qPCR) Analyse verwendet werden. Das Homogenat in 50 µL RNA Isolierung Reagenz zu beheben, extrahieren RNA und immun gen Titer von RT-qPCR zu quantifizieren (siehe z. B.Gupta und Vale16 für ein detailliertes Protokoll). Der Ausdruck der spezifischen immun gen Transkripte sollte normalisiert auf die Abschrift eines Zimmermädchen-Gens (d.h., rp49) und ausgedrückt, wie eine Falte ändern relativ Kontrolle fliegen mit 2−ΔΔCt Methode31, 32,33,34.</li>
</ol>5. Aufnahme Survivorship nach Infektion
<ol><li>Infizieren Sie fliegen mündlich wie unter Punkt 4.2 beschrieben.</li>
	<li>Übertragen Sie die infizierten oder Kontrolle fliegen von ihren jeweiligen Infektion Fläschchen in Standard Lewis Fläschchen und halten Sie in einem Inkubator bei 25 ° C in einer 12 H:12 h Hell-Dunkel-Zyklus (oder Bedingungen gewünscht). Halten Sie fliegen, bis sie tot sind.</li>
	<li>Die Anzahl von lebenden oder Toten fliegen in jedes Fläschchen täglich oder so oft wie erforderlich.</li>
	<li>Übertragen Sie die fliegen auf neue Fläschchen alle 5 Tage um die fliegen stecken in der Nahrung zu vermeiden.</li>
	<li>Präsentieren Sie diese Daten als Kaplan-Meier (KM) überleben Kurven oder bedeuten Sie ± SE proportional überleben Grundstücke. Um zu analysieren die Wirkung der verschiedenen Faktoren und/oder ihre jeweiligen Wechselwirkungen miteinander verwenden ein Statistik-Paket (z. B. das Paket "Überleben" in R33) um eine Überlebensanalyse wie Cox Proportional Gefahren Modell35auszuführen.</li>
</ol>6. Messung der bakteriellen Belastung
<ol><li>Zum gewünschten Zeitpunkt übertragen Sie eine infizierte Fliege auf einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Oberfläche zu sterilisieren die fliegen wie unter Punkt 4.4 beschrieben.</li>
	<li>Die Fliege zu homogenisieren und Quantifizierung der bakteriellen Belastung unter Verwendung des Protokolls in Schritten 4,5 – 4.10 beschrieben.</li>
</ol>7. Messen Sie bakterielle vergießen
<ol><li>Das vergießen neben der internen Belastung zu messen.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der Infektion einzelne fliegen auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für 24 h.</li>
	<li>Entfernen Sie die fliegen für die interne Last-Messung (siehe Schritt 6) und waschen Sie die Rohre mit 100 µL 1 X PBS durch Vortexen stark für 3 s.</li>
	<li>Messen Sie die KBE in dieser Wäsche durch Ausplattieren auf Nähragar LB mit dem gleichen Protokoll wie 4.6-4.8 beschrieben.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der Infektion einzelne fliegen auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für 24 h.</li>
	<li>Übertragen Sie den fliegen auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für eine weitere 24 h waschen kontaminierte Rohre mit 100 µL 1 X PBS durch Vortexen stark für 3 s.</li>
	<li>Messen Sie die KBE in dieser Wäsche durch Ausplattieren auf Nähragar LB mit dem gleichen Protokoll beschriebenen Schritte 4.6-4.8.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3 und Rekord fliegen Mortalität bei jeder Übertragung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+linear+mixed+models:+a+practical+guide+for+ecology+and+evolution.">Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution.</a> Trends Ecol Evol. 24 (3), 127-135 (2009).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genotype+and+Coinfection+Modify+the+Relationship+of+within+and+between+Host+Transmission.">Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission.</a> Am Nat. 186 (2), 252-263 (2015).</li><li>Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influence+on+disease+spread+following+arrival+of+infected+carriers.">Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers.</a> Ecol Lett. 15 (3), 186-192 (2012).</li></ol>

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für zuverlässig mündlich D. Melanogaster mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren. Wir konzentrieren uns auf p. Aeruginosa und p. Entomophila, aber dieses Protokolls kann leicht angepasst, Infektion von anderen bakteriellen Spezies, z.B. Serratia Marcescens7. ermöglichen werden Schwerpunkte dieses Protokolls variiert zwischen Bakterienarten. Dementsprechend sollten die effizienteste infektiöse Dosis, entsprechende Virulenz und Host Genotyp Anfälligkeit alle in Betracht gezogen und im Idealfall in Pilotstudien getestet. Fliegt zum Bakterienkulturen eine Reihe von optischen Dichte auszusetzen und Messen ihre infektiöse Dosis und das Überleben ist ein geeigneter Ausgangspunkt beim Arbeiten mit neuen Bakterienarten oder Leinen negativ beeinflussen.
Protokoll-Schritte wie Fliegen Hunger vor der Fütterung und erneute Aussetzung bakterielle Pellets in 5 % Saccharoselösung sind an der Tagesordnung in orale Infektion und erhöhen die Zuverlässigkeit der bakteriellen Infektion während der Belichtung7,8, 9 , 10. es ist jedoch wichtig zu beachten, dass während der Belichtung, fliegen im Wesentlichen auf einer Fläche von bakteriellen Kultur Leben. In den Prozess der zu Fuß auf diese Kultur, Bakterien werden sich auf die Fliege Oberfläche, vor allem auf die Nagelhaut oder um die Borsten24untergebracht. Diese epikutikulären Bakterien, eine erfolgreiche Enterische Infektion nicht widerspiegeln, sondern würde immer noch durch die Fliege Homogenisierung und Beschichtung nachgewiesen werden. Um das Potenzial für Fehlalarme zu reduzieren, es ist wichtig, Oberfläche fliegen durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol für bis zu 1 min zu sterilisieren.
Bei der bakteriellen vergießen Preise ist oraler Infektion unerlässlich. Die Anzahl der Erreger, die ein Host in die Umgebung freigibt ist oft schwer zu messen und die interne Belastung wird oft als Proxy für die Schwere der Infektion und daher Getriebe26,27genommen. Mess bakterielle Belastung neben bakteriellen Abbau ermöglicht die Untersuchung des Verhältnisses zwischen diesen zwei wichtigen Komponenten der Krankheit schwere und Ausbreitung38. Eine Einschränkung der vorgestellten Methode ist, dass Prüfung der internen bakteriellen Belastung von fliegen destruktive Probenahme erfordert. Dies erschwert die longitudinale Tendenzen der Erreger Wachstum und Freiraum innerhalb der gleichen Person zu untersuchen. Es ist jedoch möglich, diese Beschränkung durch destruktiv Probenahme Kohorten von Personen in verschiedenen Stadien der Infektion, unter der Annahme zu überwinden, dass die durchschnittliche Mikrobe Last in jeder Kohorte die longitudinale Erreger Dynamik in einem bestimmten widerspiegelt einzelnen. Bakteriellen Abbau leidet nicht die gleichen Einschränkungen, und wir bieten Beispiele wie vergießen quantifiziert werden kann in einer Cross-Sectional Probe oder längs zu untersuchen, wie vergießen innerhalb eines Individuums im Laufe der Zeit verändert.
Viele Gastgeber und Erreger Charakterzüge bestimmen gemeinsam eine individuelle Neigung zur Krankheit25,26,39übertragen. Während die Bedeutung dieser Eigenschaften wahrscheinlich zwischen Wirt-Pathogen-Systeme variiert, ist vergießen wahrscheinlich ein wichtiger Faktor der fäkal-orale Übertragung. Die Fähigkeit, bakteriellen Abbau Messen eröffnet die Möglichkeit, diese Annahme zu testen. Haben gekennzeichnet Wirt-Pathogen-Dynamik in einem gewünschten Panel von Fliegenschnüre, könnte Experimentatoren Oral infizieren Menschen und legen Sie sie neben nicht infizierten, anfällig für Gastgeber während ihrer ansteckenden Perioden. Diese "Empfänger" fliegen könnte dann für interne bakterielle Belastung zu verschiedenen Zeitpunkten als eine Methode zur Messung direkt Übertragung untersucht werden.

Die Fruchtfliege (auch bekannt als die Essig-Fliege), D. Melanogaster, wurde ausgiebig als Modellorganismus für die Infektion und Immunität gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern1,2eingesetzt. Dieses Werk bietet grundlegende Einsichten in die physiologischen Folgen einer Infektion und wurde auch Pionierarbeit in der Entschlüsselung der molekularen Wege zugrunde liegt die Host Immunantwort gegen Parasitoiden, Bakterien, Pilzen und virale Infektionen. Dieses Wissen ist nicht nur nützlich, um die angeborene Immunantwort von Insekten und andere Wirbellose zu verstehen, sondern weil viele der Abwehrmechanismen zwischen Insekten und Säugetieren evolutionär konserviert sind, Drosophila ist zugleich der Auslöser für der Entdeckung der wichtigsten Abwehrmechanismen bei Säugetieren, einschließlich Menschen3.
Die meisten Arbeiten an Drosophila Infektion und Immunität konzentrierte sich auf systemische Infektionen mit Impfung-Methoden, die Erreger direkt in den Körper des Insekts durch stechen oder Injektion4,5,6liefern. Der Vorteil dieser Methoden darin, dass die Lieferung einer kontrollierten infektiöse Dosis ist klar und unterstützt durch einen großen Körper der Arbeit an systemischen Infektionen. Allerdings sind viele natürlich vorkommende bakterielle Erreger von D. Melanogaster erworben durch Fütterung auf Zersetzung organischen Substanz wo Darm Immunkompetenz eine bedeutende Rolle im Host Verteidigung7,8, spielt 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Experimente, die systemische Infektionen beschäftigen diese Schutzmechanismen zu umgehen, und daher stellen ein ganz anderes Bild von wie Insekten Abwehr gegen natürliche Krankheitserreger montieren. Dies ist besonders relevant, wenn das Ziel der Arbeit ist, Vorhersagen über die Ökologie und Evolution der Infektion zu testen wo ist die Verwendung von natürlichen Krankheitserreger und Infektionswege wichtig16,17. Neuere Arbeiten hat deutlich gemacht, wie die Route der Erreger deutlich beeinflusst Krankheit Ergebnis18,19, entlockt unterschiedliche immun Wege20,21, bestimmen die schützende Wirkung von Endosymbionts16geerbt, und kann sogar spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Host Verteidigung17.
Ein weiterer Grund, mündliche Wege der Infektion zu beschäftigen ist, dass die Untersuchung der Variation bei der Übertragung der Erreger durch Messung der bakteriellen Abbau während der fäkalen Ausscheidung nach oraler Infektion22,23, können 24. Verständnis der Quellen der Host Heterogenität in der Übertragung von Krankheiten ist in natürlichen Populationen25,26herausfordernd, aber Komponenten des Getriebes, wie Erreger vergießen unter kontrollierten Laborbedingungen Messen Bedingungen bietet eine sinnvolle alternative Vorgehensweise27. Durch Fütterung fliegen Bakterien und Mess bakteriellen Abbau unter einer Vielzahl von genetischen und umweltbedingten Kontexten in kontrollierten experimentellen Bedingungen ist es möglich, Abweichungen bei der Übertragung unter Hosts zu identifizieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für mündlich D. Melanogaster mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren, und für die Quantifizierung der Bakterienwachstum und vergießen, folgt (Abbildung 1). Wir beschreiben dieses Protokoll auf zwei Pseudomonas -Bakterien: einem virulenten Stamm von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa (PA14) und ein weniger virulenten Stamm der natürlichen Erreger p. Entomophilafliegen. Pseudomonaden sind gemeinsame Gram-negativen Bakterien mit ein breites Wirtsspektrum, infizieren, Nematoden, Insekten, Pflanzen und Wirbeltiere, und finden sich in den meisten Umgebungen4,6. Enterische Infektion von Drosophila durch p. Aeruginosa und p. Entomophila führt in der Pathologie bis Darm Epithelien12,13,14,15, 28. Während wir uns auf diese zwei bakterielle Erreger konzentrieren, können die hier beschriebenen Methoden im Prinzip auf jede bakterielle Erreger von Interesse mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Nach oraler Exposition wir nach der Infektion überleben, und messen die Mikrobe Last innerhalb einzelner fliegen und lebensfähigen Mikroben Schuppen in der Umwelt, ausgedrückt in koloniebildenden Einheiten (KBE). Endlich, denn Darm Immunkompetenz ergibt sich aus einer Kombination der epitheliale Barriere und humorale Reaktionen, messen wir auch das Überleben der Fliegenschnüre, wo diese Schutzmaßnahmen gestört werden. Insbesondere Drosocrystallin (Dcy) Mutanten haben bereits gezeigt, dass anfälliger für mündliche bakterielle Infektion aufgrund einer erschöpften Peritrophic Matrix in der Darm-29. Wir messen auch überleben in ein Relish (Rel)-Mutante, die von der Produktion von antimikrobieller Peptiden gegen Gram-negativen Bakterien über die IMD Weg30behindert wird.

<table><tbody><tr><td>Vials</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>58.490</td><td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td>Agar, ash 2.0-4.5%</td></tr><tr><td>Brown sugar</td><td>Bidvest</td><td>66032</td><td>Light brown soft sugar</td></tr><tr><td>Maize</td><td>Dove&#039;s Farm</td><td></td><td>Organic maize flour</td></tr><tr><td>Fermipan yeast</td><td>Bidvest</td><td>96360</td><td>Dry, instant yeast</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td>&gt;=99.0%, crystalline</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &gt;=99.5% (HPLC)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>15788517</td><td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td></tr><tr><td>Falcon tubes (50ml)</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>210261</td><td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf tube (0.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.699</td><td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td></tr><tr><td>Eppendorf tube (1.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.690.001</td><td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International Ltd.</td><td>20821.33</td><td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td></tr><tr><td>2 L Conical Flask</td><td>VWR International Ltd.</td><td>214-0038</td><td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td></tr><tr><td>Sterile filter paper</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>1001-020</td><td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td></tr><tr><td>Bijou sample container</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>129A</td><td>7ml polystyrene sample container</td></tr><tr><td>Pseudomonas isolation agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17208</td><td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td></tr><tr><td>LB broth, Miller</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>BP1426</td><td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td></tr><tr><td>Large Embryo Collection Cages</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>59-101</td><td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td></tr><tr><td>TRI reagent solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>353072</td><td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>12649595</td><td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>CHE2068</td><td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td></tr><tr><td>Cotton wool- non absorbent</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABL</td><td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td></tr><tr><td>Cotton wool- absorbent</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABS</td><td>BP small quantity 20 bags x 500</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td></tr><tr><td>Orbital incubator</td><td>Gallenkamp</td><td>INR-200-010V</td><td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&amp;ordm;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td></tr><tr><td>Absorbance Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>ELx808&amp;trade; Absorbance Microplate Reader</td></tr><tr><td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>For Absorbance Microplate Reader</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392304</td><td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td></tr><tr><td>Step One Plus Real Time qPCR System</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4376600</td><td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td></tr><tr><td>Step One Software 2.3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td></tr><tr><td>R Statistical Software</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741015</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741065</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741045</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>774288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>739288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>740288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td></tr></tbody></table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist eines der am besten entwickelten Modellsysteme der Infektion und angeborene Immunität. Während die meisten Arbeiten auf systemische Infektionen konzentriert hat, gab es ein Anstieg des Interesses an den Mechanismen der Darm Immunkompetenz gegenüber Krankheitserregern, erfordern Methoden, mündlich fliegen zu infizieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um individuelle fliegt eine opportunistische bakterielle Erreger (Pseudomonas Aeruginosa) und eine natürliche bakterielle Erreger von D. Melanogaster (Pseudomonas Entomophila) Oral verfügbar zu machen. Das Ziel dieses Protokolls ist, ein robustes Verfahren um männliche und weibliche fliegt diese Erreger verfügbar zu machen. Wir bieten repräsentative Ergebnisse zeigen überleben Phänotypen, Mikrobe Lasten und bakterielle vergießen, was relevant für das Studium der Heterogenität bei der Übertragung der Erreger. Schließlich bestätigen wir, dass Dcy Mutanten (fehlt die schützende Peritrophic Matrix in den Darm Epithel) und genießen Sie Mutanten (fehlt einen funktionale Immunschwäche (IMD) Weg), erhöhten Anfälligkeit für bakterielle orale Infektion zu zeigen. Dieses Protokoll beschreibt daher eine robuste Methode zu infizieren fliegen mit dem oralen Weg der Infektion, die für die Untersuchung von einer Vielzahl genetischer und umweltbedingter Quellen Variation in Darm-Infektion Ergebnisse und bakterielle Übertragung erweitert werden kann.

Hier präsentieren wir Ihnen anschauliche Ergebnisse aus Experimenten wo D. Melanogaster mündlich mit p. Aeruginosa oder p. Entomophilainfiziert war. Abbildung 2 zeigt die erfolgreiche orale Infektion fliegen nach einer 12 h oder 24 h Exposition gegenüber bakteriellen Kulturen OD600 = 25 und 100 für p. Aeruginosa (Abbildung 2A) und p. Entomophila (Abb. 2 b " C), beziehungsweise. Abbildung 2 b zeigt die Bedeutung der Verwendung von konzentrierteren Kultur von p. Entomophila, gezeigt durch die Erhöhung der bakteriellen Belastung, wenn Bakterienkulturen höhere optische Dichte fliegen ausgesetzt sind. Männliche und weibliche Oregon R (OreR) fliegen klar p. Aeruginosa Infektion mit der gleichen Rate (Abbildung 3) und die gleiche Anzahl von p. Aeruginosa KBE (Abb. 4A) vergossen. Wenn jedoch infiziert mit p. Entomophila , unterscheiden sich männliche und weibliche OreR fliegen in die Anzahl der Bakterien Schuppen, in einer Weise, die im Laufe der Zeit (Abbildung 4 b) ändert. Männchen und Weibchen sterben von p. Aeruginosa (Abb. 5A) und p. Entomophila (Abb. 5 b) mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Wir sehen auch, dass Dcy Mutanten (die schützende Peritrophic Matrix in den Darm Epithel fehlt) und lustvoll Mutanten (die einen funktionellen IMD immun Weg fehlt), zeigen verminderte Überleben nach p. Entomophila und p. aeruginosa orale Infektion (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht der Protokolle zur Messung überleben, vergießen und interne bakterielle Belastung nach oraler Infektion in Drosophila Melanogaster. Eine Illustration von 3 möglichen Experimenten nach oraler Infektion von D. Melanogaster. Messen Sie das "Überleben", durch das einzelne fliegen auf Fläschchen übertragen ihre infizierte Lebensdauer. "Shedding" durch die Übertragung einzelner Flies auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 µL Lewis Medium in der Kappe zu messen. Entfernen Sie nach 24 Stunden in der Röhre die Fliege und Wirbel die Tube mit 100 µL 1 X PBS. Entfernen und Platte diese Lösung auf LB Nähragar, dem bakteriellen Abbau zu berechnen. Das Vergießen in der gleichen Fliege längs, durch Übertragung von fliegen auf frische Röhren mit Lewis Medium in der Kappe nach 24 h, und Waschen und Beschichtung jetzt kontaminierte Rohr zu messen. Eine Fliege "interne Lasten" kann gemessen werden, indem man eine infizierte Fliege, Oberfläche Sterilisieren sie, und vor dem Plattieren schließlich das Homogenat auf Nähragar LB homogenisieren. Dies kann durchgeführt werden, nach dem vergießen gemessen wurde um zu berechnen wie die "interne Lasten" und vergießen korrelieren. Die Fliege Illustration verwendet in dieser Figur wurde ursprünglich durch B. Nuhanen36gezogen. Die Autoren wurden geändert, um das Beispiel Kaplan-Meier-Kurve begleiten die Wikimedia Commons37entnommen wird. Alle anderen Abbildungen sind original. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Abbildung 2: infektiöse Dosis von Bakterien nach oraler Infektion. (A) infektiöse Dosis von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach Exposition zu einer Kultur von p. Aeruginosa (OD600 = 25) für 12 h. Der Mittelwert und SE wurden von 3 Rüden und 3 Hündinnen berechnet. (B) infektiöse Dosis von outcrossed Wildtyp Weibchen nach Exposition gegenüber einer der vier Kulturen von p. Entomophila (OD600 = 100, 75, 50 und 25) oder 5 % Saccharose Kontrolllösung für 24 h. Die Statistische Differenz (F3,76 = 18.567, p < 0,001) in die infektiöse Dosis zwischen Exposition Behandlungen ist gekennzeichnet durch unterschiedliche Buchstaben über Bars. Die Mittel wurden von den 5 fliegen für die OD600 berechnet = 0 Dosis und 18-20 für alle anderen Dosen. (C) die infektiöse Dosis von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach p. Entomophila Kultur (OD600 = 100) für 24 h. Der Mittelwert und SE wurden von 20 Männer und 20 Frauen berechnet. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Abbildung 3: Interne p. Aeruginosa Last fliegen nach oraler Infektion. Mittelwert ± SE bakterielle Belastung der männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach oraler Infektion mit p. Aeruginosa (OD600 = 25) bis zu 168 h nach der Infektion. Der Mittelwert und SE für jeden Zeitpunkt errechnen sich aus 3 Personen. Eine Fliege interne keimdruck erheblich ändert sich im Laufe der Zeit (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Abbildung 4: bakterielle nach oraler Infektion zu vergießen. (A) p. Aeruginosa Schuppen von der gleichen fliegen in Abbildung 3, bis zu 120 h nach der Infektion verwendet. Der Mittelwert und SE wurden von 3 Rüden und 3 Hündinnen berechnet. (B) p. Entomophila Schuppen von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach oraler Infektion mit p. Entomophila (OD600 = 100) bis zu 120 h nach der Infektion. Der Mittelwert und SE wurden von 34 Männer und 38 Frauen berechnet. Für p. Aeruginosa und p. Entomophila, die Anzahl der KBE Schuppen von einer Fliege deutlich ändert im Laufe der Zeit (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Abbildung 5: Überleben von fliegen nach mündlichen Bakterieninfektion. Kaplan-Meier (KM) überleben Kurven von (A) Oregon-R männlich und weiblich fliegt nach oraler Infektion mit p. Aeruginosa (OD600 = 25) oder 5 % Saccharose Kontrolllösung. Die KM überleben Kurve wurde von 4 Fläschchen von 20 fliegen pro Behandlungsgruppe berechnet. (B) OreR männliche und weibliche fliegt nach oraler Infektion mit p. Entomophila (OD600 = 100). Die KM überleben Kurve wurde aus 4 einzelnen Steuerelements fliegen und 34 infizierten fliegen für Männer und Frauen berechnet. (C) immun Mutanten: Dcy (Drosocrystallin-Peritrophic-Matrix-Mutante) und Rel (Relish-IMD Mutante), p. Entomophila (Pe), p. Aeruginosa (Pa14) oder Saccharose Kontrolllösung 5 % ausgesetzt. Alle infizierten Gruppen sterben deutlich schneller als das Steuerelement fliegt (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

11.5K Aufrufe.  University of Edinburgh. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Serie: Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Wolbachia Bakterielle Infektion in Drosophila

Forschung

Biologie

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Entwicklungsbiologie

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Immunologie und Infektion

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Infecting Flies with Bacterial Suspension Using a Nanoinjector

Source: Khalil, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2015)
This video demonstrates the nano-injection of bacterial suspension into the fly body cavity, resulting in bacterial multiplication and infection. The fly&#39;s immune response clears some bacteria, while others escape immune clearance and survive within the host causing an infection.

Infizieren von Fliegen mit Bakteriensuspension unter Verwendung eines Nanoinjektors

Source: Khalil, S. et al., Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2015)
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host-Pathogen Interaction

A Septic Pinprick Technique to Introduce Systemic Bacterial Infection in Flies

Source: Khalil, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique to infect Drosophila by introducing a pathogenic bacteria directly into their body cavity. This method bypasses epithelial barriers and other passive defense mechanisms, allowing for the induction of systemic infection. Upon infection, the resulting immune response is assessed by monitoring fly mortality and performing downstream assays.

Eine septische Nadelstichtechnik, um systemische bakterielle Infektionen bei Fliegen einzuführen

Source: Khalil, S., et al. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)
This video ...

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Source: Khalil, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. &#160;(2015)
In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

Source: Khalil, S., et al. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. &#160;(2015)
In this video, ...

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

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