Name: oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster at JoVE.com

이 작품 면역, 감염 및 진화 (http://ciie.bio.ed.ac.uk; 그랜트 참조 번호 095831)에 대 한 센터를 위한 Wellcome 트러스트에서 전략적 수상에 의해 지원 되었다. PFV는 브 랑 코와 이즈 친교 (https://brancoweissfellowship.org/)와 장관의 친목 (생물 과학의 학교에 딘 버 러의 대학);에 의해 지원 되었다 JASJ는 NERC E3 DTP 박사 재학에 의해 지원 되었다.

1. 파리를 유지
<ol><li>갓 만든된 루이스 매체의 7 mL를 포함 하는 23 mL 플라스틱 튜브에 파리를 유지 (참조31;에서 수정 1 L 트리플 H2O, 6.1 g 한 천, 93.6 g 갈색 설탕, 68 g 옥수수, 18.7 g 인스턴트 이스트, 15 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트 소 주) 인큐베이터에서 25 ± 1 ° C에서 12 h:12에서 h 빛: 다크 ~ 60% 습도 주기. 비 흡수 성 목화와 튜브를 연결 합니다.</li>
	<li>모든 14 일 후 발생 달걀 누워 수 있도록 2-3 일에 대 한 표면에 추가 하는 인스턴트, 건조 효 모와 20-30 성인 새로운 음식 유리병을 전송. 이 기간 후 계란의 표면에 표시 됩니다 확인 합니다. 성인 파리를 제거 합니다. 참고: 이렇게 하면 파리 튜브에 단일 세대, 인구 나이 일치 합니다.</li>
	<li>개발 계란을 둡니다. 참고: 25 ° C에서 성인 파리 시작 eclose pupae에서 날 11 및 12-14 일 동안 계속.</li>
</ol>2. 준비 실험 파리
<ol><li>효 모 반죽 확산 (혼합 건조 효 모와 75 mL 애플 한 접시 (1 L 증류수 H2O, 30 g 한 천, 33 g 자당, 330 mL 사과 주스, 7 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트 트리플)에 인구/배아 컬렉션에에서 부모 세대의 달걀을 수집 땅콩 버터 같은 일관성을 물). 수 분을 제공 하기 위해 감 금 소를 물에 젖은 탈지 면을 추가 합니다. 참고: 애벌레 양육 밀도 차이 의해 발생 하는 효과 혼동을 피하기 위해, 그것은 중요 한 다른 튜브에 실험적인 파리 비슷한 밀도에 reared 있습니다. 위의 단계는 효과 혼동을 피하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>12 h:12 h에서 25 ° C에서 24 h에 대 한 품 어 빛: 다크 사이클 계란-누워 발생 했습니다 때까지. 24 시간 후 너무 계란 경우 habituation 장기간을 제공 합니다. 애플-한 천 배지를 대체 하 고 더 24 h에 대 한 발생을 낳는 허용.</li>
	<li>인구 케이지에서 계란 라덴 애플-한 천 배지를 가져가 라. Agar의 표면에서 나머지 효 모 반죽과 어떤 죽은 파리를 제거 합니다.</li>
	<li>잠수함 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 20 mL에 한 천 하 고 부드럽게 잘 붓으로 애플 천에서 계란을 꺼내. PBS에서 일시 중지 하는 동안 50 mL 원심 분리기 튜브에 계란을 전송 및 계란 밑에 침 몰 5 분 두고. 참고: 대부분 계란은 agar의 외부 가장자리에 있다.</li>
	<li>하단의 p1000 필터링 된 피 펫 팁의 4 m m 절단 하 여 제거 하 고 피 펫 팁 50 mL 원심 분리기 튜브의 아래쪽에서 가져온 솔루션의 1 mL를 사용 하 여. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 이것을 전송 하 고 정착 있습니다. 참고: 때 달걀을 pipetting 스냅 해제 플런저는 부드러운 출시 보다 더 효율적인.</li>
	<li>하단의 p20 필터링 된 피 펫 팁의 4 m m 절단 하 여 제거 합니다. 원하는 볼륨을 피펫으로 설정 하 고 microcentrifuge 튜브의 아래쪽에서 그립니다. 참고: 연습, 5 µ L의 볼륨 약 100 계란을 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>음식에 수집 된 계란을 분배 하 고 필요한 양의 시간에 대 한 개발에 그들을 두고.</li>
</ol>3. 세균성 문화
<ol><li>P. entomophila 와 P. 농 균 문화 성장, 30 ° C에서 냉동 세균성 주식 100 µ L와 Luria Bertani (파운드) 국물의 10 mL 접종 (P. entomophila) 와 37 ° C (P. 녹 농 균), 각각. 150 rpm에서 밤새 흔들어. 세균성 문화 채도 단계에 도달 하면 확인 하십시오.</li>
	<li>보장 하기 위해 파리를 접종에 사용 되는 박테리아에 지 수 단계 있고 다음 아침을 원하는 볼륨의 새로운 subculture에 하룻밤 문화 접종 빠르게 복제. 사전 inoculum subculture 문화의 총 볼륨의 10% 인지 확인 합니다. 참고: 구두 감염 필요 높은 합니다. 그것은 따라서 원하는 복용량 및 실험적인 크기에 대 한 충분 한 접종 문화를 생산할 수 있도록 상당한 양의 세균성 문화를 성장 하는 데 필요한. 얼마나 많은 서브 컬쳐 방정식 MsVs 를 사용 하 여 필요한 감염 복용량을 생산 하기 위해 필요한 계산 = M나Vi, M 문화를 나타냅니다의 광학 밀도 측정 600 nm (OD600) 값과 V에서 대표는 볼륨입니다. 아래 첨자 문자 문화 subculture (s) 또는 (i) 감염 복용량으로 사용 여부를 참조 하십시오.</li>
	<li>Subculture의 표면 플라스 크의 슬로프의 시작 부분 (대부분) 바로 위에 떨어지는 그런 볼륨에서 2 L 원뿔 플라스 크에이 하위를 성장. 그것은 박테리아의 성장을 스턴 트 것으로이 마크 위에 작성 하지 마십시오.</li>
	<li>OD 매 30 분을 측정 하 여 지 수 성장 단계에이 subculture에 박테리아가 확인 합니다. 참고:이 발생 후 3-5 h, subculture에 0.6-0.8 사이 세600 를 도달 하는 곳.</li>
	<li>이 하위의 동일한 볼륨 50 mL에 걸쳐 원심 분리기 튜브와 박테리아를 펠 렛을 4 ° C에서 15 분 동안 2500 x g에서 subculture 스핀. 일단 일지도, 제거 하 고 다시 박테리아의 대부분의 제거를 확인 하는 위의 조건에 상쾌한 스핀. 참고: 무시할 수 크기 (높이 1 m m 보다 작은)의 펠 릿이 확인합니다.</li>
	<li>다시 표면에 뜨는 subculture의 5 ml에서 그들을 중단 하 고 진상을 단일 50 mL 튜브에 이러한 솔루션으로 별도 튜브의 세균성 펠 릿을 결합 한다. 박테리아를 펠 렛을 4 ° C에서 15 분 동안 2500 x g에서 집중된 문화가 스핀.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 다시 5% 자당 물 솔루션에서 최종 박테리아 펠 릿을 일시 중단 합니다. 마약을 확인 하 고 원하는 감염 복용량을 조정 (OD600 100 P. entomophila8 세600 = = 25 P. 농 균16,28), 다시 5%에는 펠 릿을 일시 중단 하 여 필요한 볼륨을 자당 물 솔루션입니다. 참고: 추가 5% 자당 물 솔루션의 금액 산출 될 수 있다 단계 3.2.1에서에서 방정식을 사용 하 여 (MsVs M나Vi=).</li>
</ol>4. 구두 파리 감염
<ol><li>을 보장 하기 위해 구강 감염 박테리아에 노출 하기 전에 2-4 h에 대 한 파리 파리 표준 한 천 병 (1 리터 트리플 증 7 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트, 84 g 갈색 설탕, 20 g 한 천, H2O)를 전송 하 여 굶 어.</li>
	<li>파리는 굶 어 되는 하는 동안 감염 병을 준비 합니다. 슈 도모 나 스 감염 병의 표준 설탕 agar pipetting 500 µ L에 의해 7 mL 샘플 튜브의 뚜껑으로 만들고 건조 두고. 뚜껑에 필터 종이의 디스크를 놓고 100 µ L 세균성 문화 필터 디스크에 직접의 플라스틱. 제어 감염, 세균성 문화를 같은 볼륨 필터 종이에 5% 자당 물 솔루션을 바꿉니다.</li>
	<li>샘플 튜브를 단일 파리를 추가 하 고 18-24 h에 대 한 둡니다.</li>
	<li>구강 감염을 확인, 처음 세균 노출 후 즉시 파리 표면 소독, 20-30 미에 대 한 70% 에탄올의 100 µ L에 그들을 배치 하 여 제거 하는 에탄올 고 추가 100 µ L 트리플의 증류수 20-30 s 물을 제거 하기 전에. 1 x PBS의 100 µ L을 추가 하 고 비행을 균질.</li>
	<li>96 잘 접시의 맨 위 행에는 homogenate를 전송 하 고 아래 모든 잘을 1 x PBS의 90 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>직렬 CFU의 범위 값을 구별 하는 것이 샘플 희석. 최고 잘에는 homogenate의 10 µ L 고 아래 우물이 추가. 이 단계를 반복 두 번째 잘, 잘, 세 번째에 10 µ L를 전송 하 고, 필요에 따라 많은 직렬 희석에 대 한. 참고: 그것은 중요 한 새로운 피 펫 팁 희석의 각 집합에 대해 사용 됩니다.</li>
	<li>모든 방울 이산 유지 되도록 5 µ L 방울에 파운드 영양 한 천 배지에서 직렬 희석 접시</li>
	<li>P. entomophila 와 P. 녹 농 균, 하룻밤 30 ° C에서 37 ° C 파운드 한 천 배지를 각각 품 어 및 볼 수 CFUs. 참고: 지금까지 초파리 본질적인 미생물에서는 뚜렷한 혐 기성 성장 조건에 필요에 선택적 매체, 예를 들면 녹 절연 매체 (PIM), 슈 도모 나 스 CFUs만 계산 되도록 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>10-60 CFUs 명확 하 게 볼 수 있습니다 직렬 희석에 식민지의 수를 계산 하 여 비행 당 CFUs의 수를 계산 합니다. 다음 비행 당 박테리아의 수를 계산 하려면 현재 희석 비율을 곱하면 됩니다.</li>
	<li>통계 분석을 수행 합니다. 필요한 경우, 정규 분포를 비행 당 CFUs를 변환 합니다. 이렇게 로그 변환 합니다. 일단 변환, 일반화 선형 모델 (GLMs)30,,3132 를 사용 하 여 어떻게 치료 그룹 비행 (R33등 일반적으로 사용 가능한 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여) 당 CFUs에 다른 테스트. 참고: 나머지 비행 homogenate 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량) 분석을 통해 유전자 발현을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. RNA 분리 시 약의 50 µ L에는 homogenate를 수정, RNA, 추출 및 실시간 정량 Pcr에 의해 특정 면역 유전자 titers 계량 ( 예를 들어, 참조 자세한 프로토콜에 대 한 굽타와 베일16 ). 특정 면역 유전자 성적 표현 한다 내부 관리 유전자 (즉, rp49)의 증명서 수준에 정상화 하 고 배 2−ΔΔCt 메서드31를 사용 하 여 제어 파리 기준 변경으로 표현 32,,3334.</li>
</ol>5. 녹음 Survivorship 감염 다음
<ol><li>4.2 단계에 설명 된 대로 구두로 감염 파리.</li>
	<li>감염 전송 또는 표준 루이스 리 바이 알 및 빛-어둠 12 h:12 h에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 유지에 그들의 각각 감염 병에서 제어 파리 주기 (혹은 조건). 그들은 죽은 때까지 파리를 유지.</li>
	<li>살아있는 또는 죽은 파리 각 유리병 매일, 또는 필요에 따라 자주의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>파리에 전송 새로운 튜브 5 일 마다 음식에 갇혀 지 고 파리를 피하기 위해.</li>
	<li>카 플 란-마이어 (KM) 생존 곡선으로이 데이터를 제시 하거나 ± SE 비례 생존 음모를 의미 합니다. 분석 하려면 여러 가지 요소와 그들의 각각 상호 작용의 효과 콕스 비례 위험 모델35등 생존 분석을 실행 하려면 통계 패키지 (예를 들어 패키지 R33에서 "생존")를 사용 합니다.</li>
</ol>6. 세균 부하 측정
<ol><li>원하는 시간 시점에서 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 하나의 감염 된 비행을 전송 합니다.</li>
	<li>표면 소독 파리 4.4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>비행을 균질 하 고 세균성 부하 단계 4.5-4.10에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 계량.</li>
</ol>7. 측정 세균성 흘리기
<ol><li>내부 부하와 함께 피 눈물을 측정 합니다.</li>
	<li>감염 후 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 포함 된 50 µ L 24 h에 대 한 루이스 매체의 전송.</li>
	<li>내부 부하 측정에 대 한 파리를 제거 (하십시오 6 단계 참조) 무 겁 게 3에 대 한 vortexing에 의해 1 x PBS의 100 µ L 튜브를 세척 하 고 s.</li>
	<li>이 세척에 CFUs 파운드 영양 한 천 4.6-4.8 단계에서 설명한 대로 동일한 프로토콜을 사용 하 여, 도금 측정.</li>
	<li>감염 후 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 포함 된 50 µ L 24 h에 대 한 루이스 매체의 전송.</li>
	<li>파리 여를 전송 추가 24 h. 세척에 대 한 루이스 매체의 ~ 50 µ L을 포함 하는 새로운 microcentrifuge 튜브 100 µ L 1 x PBS의 오염 된 튜브 vortexing 무 겁 게 3에 대 한 s.</li>
	<li>이 세척에 CFUs 파운드 영양 한 천 4.6-4.8 단계에서 설명한 동일한 프로토콜을 사용 하 여, 도금 측정.</li>
	<li>모든 전송에서 단계 7.2와 7.3 및 기록 비행 사망률을 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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우리는 안정적으로 구두로 D. melanogaster 세균성 병원 균 감염에 대 한 프로토콜을 제시. 우리 피 녹 농 균 및 P. entomophila에 초점을 맞추고 있지만이 프로토콜 쉽게 다른 세균 종, 예를 들어, Serratia marcescens7. 의 감염 수 있도록 적용할 수 이 프로토콜의 주요 측면은 세균성 종 사이 달라 집니다. 따라서, 가장 효율적인 감염 복용량, 해당 독성 및 호스트 유전자 감수 해야 모두 간주 되며 이상적으로 파일럿 연구에서 테스트. 다양 한 광학 밀도의 세균성 문화에 파리를 제공 하 고 그들의 감염 복용량 및 생존 측정 새로운 세균성 종 또는 비행 라인 작업할 때 적절 한 시작 지점입니다.
프로토콜 단계와 같은 비행 수 유 전에 기아 고 5% 자당 해결책에 다시 중단 세균성 펠 릿 평범 구강 감염에 노출7,8, 중 세균 감염의 안정성 향상 9 , 그러나 10., 그것은 노출, 동안 파리 본질적으로 살고 있는 세균성 문화의 표면에 주의 하는 것이 중요. 이 문화에 산책 하는 과정에서 박테리아 파리의 표면, 특히 표 피 또는 bristles24주위에 박 혀 될 것 이다. 이 epicuticular 박테리아, 성공적인 장 감염을 반영 하지 않습니다 하지만 여전히 비행 균질 및 도금에 의해 검출 될 것. 잘못 된 반응에 대 한 가능성을 줄이기 위해, 그것은 표면에 필수 최대 1 분 동안 70% 에탄올에 침수를 통해 파리를 소독.
세균의 발산 속도 고려할 때 구강 감염 필수적 이다. 호스트 환경에 출시 하는 병원 균의 수는 종종 측정 하기 어려운 고 내부 부하 따라서 전송26,27감염의 심각도 대 한 프록시로 종종 이루어집니다. 세균성 피 눈물 함께 측정 세균성 부하 질병의 심각도 및 확산38의 이러한 두 가지 중요 한 구성 요소 사이의 관계의 시험을 수 있습니다. 제시 하는 방법의 한 가지 한계는 파괴적인 샘플링을 필요 시 금 파리의 내부 세균 부하 이다. 이것은 병원 체 성장과 동일한 개인 내의 클리어런스의 경도 동향 조사를 어려운 있습니다. 그러나, 각 코 호트에서 평균 미생물 부하 주어진 내에서 경도 병원 체 역학을 반영 한다는 가정 아래 감염의 다른 단계에서 개인의 파괴적 샘플링 동료에 의해이 제한을 극복 하기 위해 가능 하다 개별. 세균성 피 눈물 같은 한계에서 고통을 하지 않습니다 그리고 우리가 어떻게 발산 수 정해질 횡단면 샘플에서 또는 경도 조사 어떻게 개인 내에서 시간이 지남에 따라 발산 하의 예를 제공 합니다.
많은 호스트와 병원 체 특성은 공동으로 질병25,,2639를 전송 하는 개인의 성향을 결정 합니다. 가능성이 이러한 특성의 의미 호스트 병원 체 시스템 사이 변화 한다, 하는 동안 흘리는 찌 끼 구두 전송의 주요 결정 가능성이 높습니다. 세균성 흘리기를 측정 하는 능력이이 가설을 테스트 하는 기회를 엽니다. 플라이 라인의 원하는 패널에서 호스트 병원 체 역학, 성격 경험 수 구두 감염 개인, 그리고 그들의 전염 성 기간 동안 감염, 감염 호스트와 함께 그들을 배치. 이러한 '받는 사람' 파리 직접 전송 측정의 방법으로 다양 한 시간 점에서 내부 세균 부하에 대 한 분석 다음 수 있습니다.

과일 파리 (로 알려진 식초 비행), D. melanogaster, 광범위 하 게 사용 되었습니다 모델 생물으로 감염 및 병원 체1,2의 다양 한에 대 한 면역에 대 한. 이 작품은 감염의 생리 적인 결과에 대 한 근본적인 통찰력을 제공 하고있다 하 고 또한 기본 parasitoid, 세균, 곰 팡이, 및 바이러스 감염에 대 한 호스트 면역 반응을 분자 경로 탈피에 개척 했다. 이 지식 뿐만 아니라 곤충과 다른 무척 추 동물의 타고 난 면역 반응을 이해 하는 데 유용 하지만 초파리 발견이는 했다 면역 메커니즘의 많은 곤충과 포유류 사이 보존 진화론은, 때문에 또한 있다 포유류에서 주요 면역 메커니즘의 인간3를 포함 하 여.
Drosophila 감염 및 면역에 대부분 작업 조직의 감염, 샤프트의 또는 분사4,,56곤충의 몸으로 직접 병원 균을 제공 하는 접종 방법을 사용 하 여에 집중 했다. 허용 제어 감염 복용량의 납품에이 방법의 장점은 명확 하 고 조직의 감염에 대 한 작업의 큰 몸에 의해 지원. 그러나 D. melanogaster 의 많은 자연적 사건 세균 병원 균 용기 immunocompetence 호스트 방어7,8, 에 중요 한 역할을 담당 하는 유기 물 분해에 먹이 통해 취득 되는, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 조직의 감염을 사용 하는 실험 이러한 방어를 무시 하 고, 따라서 곤충 자연 병원 균에 대 한 방어를 탑재 하는 방법의 완전히 다른 그림을 제공. 이것은 특히 관련 된 작업의 목표 어디 자연 병원 체의 사용 및 감염의 경로 중요 한16,17생태와 감염의 진화에 대 한 예측을 테스트 하는 경우 이다. 최근 작품 병원 체에 의해 크게 촬영 경로 질병 결과18,19에 미치는 영향을 강조 했다, 고유 면역 경로20,21elicits의 보호 효과 확인할 수 있습니다. endosymbionts16, 상속 그리고 심지어 플레이 호스트 방어17의 진화에 중요 한 역할을 수 있습니다.
또 다른 이유는 감염의 구두 노선 고용 배설물 배설 구강 감염22,23, 를 다음 중 세균성 흘리기를 측정 하 여 변화 조사 병원 체 전송에서 수 있다는 점입니다 24. 자연 인구25,26, 도전 호스트가 질병 전송에서의 소스를 이해 하지만 전송, 제어 실험실에서 발산 하는 병원 체 등의 구성 요소를 측정 조건27유용한 대체 접근 제공 합니다. 먹이 파리 박테리아와 유전과 환경 컨텍스트 제어 실험 조건에서의 다양 한에서 발산 하는 측정 박테리아, 전송 호스트 사이에서 변이의 소스를 식별 가능 하다.
여기, 우리가 구두 D. melanogaster 세균성 병원 균 감염에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 박테리아의 성장을 측정 하 고 흘리기에 대 한 그 다음 (그림 1). 우리 두 슈 도모 나 스 박테리아에이 프로토콜 설명: 피 녹 농 균 (PA14), 기회 주의 병원 체의 악성 긴장 그리고 병원 체 P. entomophila비행 자연의 보다 적게 악성 긴장. Pseudomonads는 광범위 한 호스트 범위, 곤충, 선 충, 식물 및 척추 동물, 감염 일반적인 그람 음성 박테리아 이며 대부분 환경4,6에서 발견 된다. 장 epithelia12,13,,1415, 병리학에서 결과 초파리 피 녹 농 균 및 P. entomophila 의 장 감염 28. 그러나 우리가이 두 세균성 병원 체에 초점을, 여기에 설명 된 방법은 적용할 수 있는 원칙에 작은 수정에 대 한 관심의 모든 세균성 병원 체에. 구두 노출, 다음 우리는 감염 된 후 생존, 측정 하 고 개별 파리 내 미생물 부하 측정 그리고 가능한 미생물 환경, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 표현으로 창 고. 마지막으로, 발생 하기 때문에 창 자 immunocompetence 상피 방 벽 및 체액 응답의 조합에서 우리는 또한 이러한 방어 방해는 비행 거리 선의 생존을 측정 합니다. 특히, Drosocrystallin (Dcy) 돌연변이 이전 용기29에 고갈 된 peritrophic 매트릭스 때문에 구강 세균 감염에 더 취약 되도록 표시 되었습니다. 우리는 또한 IMD 통로30를 통해 그람 음성 세균에 대해 항균 성 펩 티 드 생산에서 장애가 있는 양념 (Rel) 돌연변이에 생존을 측정 합니다.

<table><tbody><tr><td>Vials</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>58.490</td><td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td>Agar, ash 2.0-4.5%</td></tr><tr><td>Brown sugar</td><td>Bidvest</td><td>66032</td><td>Light brown soft sugar</td></tr><tr><td>Maize</td><td>Dove&#039;s Farm</td><td></td><td>Organic maize flour</td></tr><tr><td>Fermipan yeast</td><td>Bidvest</td><td>96360</td><td>Dry, instant yeast</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td>&gt;=99.0%, crystalline</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &gt;=99.5% (HPLC)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>15788517</td><td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td></tr><tr><td>Falcon tubes (50ml)</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>210261</td><td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf tube (0.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.699</td><td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td></tr><tr><td>Eppendorf tube (1.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.690.001</td><td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International Ltd.</td><td>20821.33</td><td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td></tr><tr><td>2 L Conical Flask</td><td>VWR International Ltd.</td><td>214-0038</td><td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td></tr><tr><td>Sterile filter paper</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>1001-020</td><td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td></tr><tr><td>Bijou sample container</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>129A</td><td>7ml polystyrene sample container</td></tr><tr><td>Pseudomonas isolation agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17208</td><td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td></tr><tr><td>LB broth, Miller</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>BP1426</td><td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td></tr><tr><td>Large Embryo Collection Cages</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>59-101</td><td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td></tr><tr><td>TRI reagent solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>353072</td><td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>12649595</td><td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>CHE2068</td><td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td></tr><tr><td>Cotton wool- non absorbent</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABL</td><td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td></tr><tr><td>Cotton wool- absorbent</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABS</td><td>BP small quantity 20 bags x 500</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td></tr><tr><td>Orbital incubator</td><td>Gallenkamp</td><td>INR-200-010V</td><td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&amp;ordm;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td></tr><tr><td>Absorbance Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>ELx808&amp;trade; Absorbance Microplate Reader</td></tr><tr><td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>For Absorbance Microplate Reader</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392304</td><td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td></tr><tr><td>Step One Plus Real Time qPCR System</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4376600</td><td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td></tr><tr><td>Step One Software 2.3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td></tr><tr><td>R Statistical Software</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741015</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741065</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741045</td><td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>774288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>739288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L filtered pipette tips</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>740288</td><td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td></tr></tbody></table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

과일 파리 초파리 melanogaster 감염 및 타고 난 면제의 최고의 개발된 모델 시스템 중 하나입니다. 대부분의 작업은 조직의 감염을 중점적으로, 구두로 파리 감염 방법이 필요로 하는 병원 균을 창 자 immunocompetence의 메커니즘에 대 한 관심의 최근 증가 되었습니다. 여기 선물이 구두로 개별 파리 기회 주의 세균성 병원 체 (녹 농 균)와 D. melanogaster (녹 entomophila)의 자연 스러운 세균성 병원 체에 노출 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 목표는 이러한 병원 균을 남성과 여성의 파리를 노출 하는 강력한 방법을 제공. 우리는 관련 병원 체의 전송에 있는 연구에 대 한 생존 고기, 미생물 부하, 흘리기, 박테리아를 보여주는 대표적인 결과 제공 합니다. 마지막으로, 우리 확인 Dcy 돌연변이 (창 자 상피의 보호 peritrophic 매트릭스 부족) 및 돌연변이 (부족 기능 면역 결핍 (IMD) 통로) 양념, 구강 세균 감염에 걸릴 표시. 이 프로토콜은 따라서, 파리 감염, 창 자 감염 결과 세균 전송에 변화의 다양 한 유전과 환경 자원의 연구에 확장 될 수 있는 구강 경로 사용 하 여 감염 하는 강력한 방법을 설명 합니다.

여기, 선물이 실험에서 설명 결과 D. melanogaster P. 농 균 또는 P. entomophila구두로 감염 되었다. 그림 2 설명 OD600 의 세균성 문화에 12h 또는 24h 노출 기간에 따라 파리의 성공적인 구강 감염 = 25, 100 P. 녹 농 균 (그림 2A)을 P. entomophila (그림 2B C), 각각. 그림 2B P. entomophila, 파리 큰 광학 밀도의 세균성 문화에 노출 되 면 세균성 부하에서 증가 의해 표시의 더 집중된 문화 사용의 중요성을 보여 줍니다. 남성과 여성의 오 레 곤 R (OreR) 파리 같은 속도 (그림 3) P. 녹 농 균 감염 하 고 피 농 균 CFUs (그림 4A)의 동일한 수를 창 고. 그러나 P. entomophila 감염, 남성과 여성의 OreR 파리 (그림 4B) 시간에 따라 변화 하는 방식으로 박테리아 헛간의 수에 차이가 있습니다. 남성과 여성 서로 다른 속도로 P. 녹 농 균 (그림 5A), P. entomophila (그림 5B)에서 죽어. 우리는 또한 Dcy 돌연변이 (이 창 자 상피의 보호 peritrophic 매트릭스 부족) 및 양념 돌연변이 (이 기능 IMD 면역 통로 부족), 다음 P. entomophila 및 P. 농 균 감소 생존 표시 참조 구강 감염 (그림 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> 그림 1: 생존, 흘리기, 그리고 초파리 melanogaster구강 감염 다음 내부 세균 부하를 측정 하기 위한 프로토콜의 개요 개요. 3 잠재적인 실험 D. melanogaster의 구강 감염을 다음의 그림. 튜브를 단일 파리를 전송 하 고 감염 된 그들의 수명을 기록 하 여 '생존'을 측정 합니다. '피 눈물' 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 뚜껑에 루이스 매체의 50 µ L 전송 하 여 측정 합니다. 튜브에서 24 시간 후 비행 및 소용돌이 1 x PBS의 100 µ L로 튜브를 제거 합니다. 제거 하 고 파운드 영양 한 천 세균성 흘리기 계산 하에이 솔루션을 접시. 흘리기 동일한 비행에 경도, 24 h 후 뚜껑에 루이스 매체와 신선한 튜브에 파리를 전송 하 고 세척 하 고 지금 오염 된 튜브를 도금 하 여 측정 합니다. 파리의 '내부 부하'는 감염 된 비행, 표면 살 균, 그리고 마지막으로 파운드 영양 한 천에 homogenate를 도금 하기 전에 조직 하 여 측정할 수 있습니다. 이 계산에 측정 되었다 흘리기 후 수행할 수 있습니다 어떻게 '내부 부하'와 발산 상관. 이 그림에 사용 된 플라이 그림 원래 B. Nuhanen36에 의해 그려진 했다. 저자는 위키미디어37에서 찍은 예 카 플 란-마이어 곡선을 동반 하는 그것을 수정 했습니다. 다른 모든 삽화는 원래. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> 그림 2: 다음 구강 감염 박테리아의 감염 복용량. (A) 남성 및 여성의 오 레 곤-R의 감염 복용량 P. 농 균 문화에 노출 다음 파리 (OD600 = 25) 12 h에 대 한. 평균 및 SE 3 남성 3 여성에서 계산 했다. 4 P. entomophila 문화 중 하나에 노출 다음 outcrossed 야생 형 암컷의 (B) 감염 복용량 (OD600 = 100, 75, 50, 그리고 25) 24 시간 5% 자당 해결책을 제어 또는. 통계적 차이 (F3,76 = 18.567, p < 0.001) 노출 치료 사이 감염 복용량에 바 위에 다른 문자로 표시 됩니다. 수단 OD600 5 파리에서 계산 된 = 0 복용량, 및 모든 다른 복용량에 대 한 18-20. (C) 남성과 여성의 오 레 곤-R의 감염 복용량 P. entomophila 문화에 노출 다음 파리 (OD600 = 100) 24 h에 대 한. 평균 및 SE 20 남성 및 20 여성에서 계산 했다. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> 그림 3: 내부 P. 농 균 부하 구강 감염 후 파리에서. 남성 및 여성의 오 레 곤-R의 평균 ± SE 세균성 부하 P. 농 균 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 25) 최대 168 h 후 감염. 평균 고 각 시간 점의 SE 3 개인에서 계산 됩니다. 파리의 내부 세균 부하 시간에 따라 크게 변화 (p < 0.001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> 그림 4: 구강 감염에 따라 발산 하는 박테리아. (A) P. 농 균 같은 파리 하는 데 사용 그림 3에서에서 최대 120 h 후 감염에 의해 창 고. 평균 및 SE 3 남성 3 여성에서 계산 했다. 남성과 여성의 오 레 곤-R에 의해 창 고 (B) P. entomophila P. entomophila 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 100) 감염 된 후 120 h까지. 평균 및 SE 34 남성과 38 여성에서 계산 했다. P. 녹 농 균 및 P. entomophila, 비행에 의해 CFUs 헛간의 수는 크게 시간에 따라 변화 (p < 0.001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> 그림 5: 구강 세균 감염 다음 파리의 생존. 카 플 란-마이어 (KM) (A) 오 레 곤-R 남성과 여성의 생존 곡선 P. 농 균 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 25) 또는 5% 자당 해결책을 제어. KM 생존 곡선 처리 그룹 당 20 파리의 4 튜브에서 계산 했다. (B) 남성 및 여성 OreR P. entomophila 구강 감염 후 파리 (OD600 = 100). KM 생존 곡선 4 단일 제어 파리와 남성과 여성 모두에 대 한 34 감염 된 파리에서 계산 했다. (C) 면역 돌연변이: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic 매트릭스 돌연변이) 및 Rel (양념-IMD 돌연변이), P. entomophila (Pe), P. 녹 농 균 (Pa14), 또는 제어 5% 자당 솔루션에 노출. 모든 감염 된 그룹 컨트롤 파리 보다 더 빨리 크게 다이 (p < 0.001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

이 프로토콜에는 구두 노출 및 감염 세균성 병원 체, 과일 파리 초파리 melanogaster 하 고 전염 성 박테리아 헛간 창 자 감염을 다음의 수를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 비행 생존 다음 구강 세균 감염에 면역 돌연변이의 효과 설명 합니다.

세균성 감염 및 Shedding 초파리 melanogaster 에

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

11.5K 조회수.  University of Edinburgh. 이 프로토콜에는 구두 노출 및 감염 세균성 병원 체, 과일 파리 초파리 melanogaster 하 고 전염 성 박테리아 헛간 창 자 감염을 다음의 수를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 비행 생존 다음 구강 세균 감염에 면역 돌연변이의 효과 설명 합니다.

비디오: Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Drosophila에서 Wolbachia 세균 감염

연구

생물학

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

발생학

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

면역학 및 감염병학

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Infecting Flies with Bacterial Suspension Using a Nanoinjector

Source: Khalil, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2015)
This video demonstrates the nano-injection of bacterial suspension into the fly body cavity, resulting in bacterial multiplication and infection. The fly&#39;s immune response clears some bacteria, while others escape immune clearance and survive within the host causing an infection.

나노 인젝터를 사용하여 박테리아 현탁액으로 파리를 감염시키는 것

Source: Khalil, S. et al., Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2015)
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host-Pathogen Interaction

A Septic Pinprick Technique to Introduce Systemic Bacterial Infection in Flies

Source: Khalil, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique to infect Drosophila by introducing a pathogenic bacteria directly into their body cavity. This method bypasses epithelial barriers and other passive defense mechanisms, allowing for the induction of systemic infection. Upon infection, the resulting immune response is assessed by monitoring fly mortality and performing downstream assays.

파리에 전신 세균 감염을 도입하는 패혈성 바늘찌 기술

Source: Khalil, S., et al. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)
This video ...

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Source: Khalil, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52613">Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. &#160;(2015)
In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection(대장균 감염 후 Drosophila melanogaster의 대장균 박테리아 부하)

Source: Khalil, S., et al. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. &#160;(2015)
In this video, ...

세균성 감염 및 Shedding 초파리 melanogaster 에

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