Este trabalho foi financiado pelo NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Reconhecemos o Mark Slabodnick e Natalie Kirkland para desenvolver as versões iniciais de alguns desses protocolos e discussões informativas. Agradecemos a Karina Perlaza e Greyson Lewis pela leitura crítica do manuscrito.

<ol><li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(00)81685-2">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li>
<li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10611685">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li>
<li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecules+to+morphology%3A+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li>
<li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrankel%2C+J+%22Pattern+Formation%3A+Ciliate+Studies+and+Models%22">Pattern Formation: Ciliate Studies and Models</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1989).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401310105/full">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li>
<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1050120105/abstract">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1535709">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li>
<li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-repairing+cells%3A+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li>
<li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848(2013).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22Biology+of+Stentor%22">Biology of Stentor</a>. , Pergammon Press. Oxford. (1961).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861(2014).</li>
<li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+E+%22The+Chlamydomonas+sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+its+laboratory+use%22">The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use</a>. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Cultivo de Stentor apresenta uma série de desafios. Em primeiro lugar, para realizar experimentos que exigem um grande número de células, é necessário manter um grande número de culturas Stentor , como as culturas se tornam insalubres quando Stentor concentração excede 20 células/mL. Em segundo lugar, os organismos que podem contaminar Stentor culturas muitas vezes dividem mais rápido que Stentor e oprimem a cultura (um contaminante comum é rotíferos). Assim, é necessário verificar periodicamente o a cultura sob um microscópio e remover os contaminantes. Ocasionalmente, uma nova cultura precisa ser iniciado a partir de um pequeno número de células manualmente resgatou uma cultura contaminada. Isto aumenta o tempo necessário para se manter saudável Stentor culturas. Em terceiro lugar, expandindo uma única célula em uma cultura de 400 mL requer pelo menos um mês, porque o ciclo celular de Stentor é 3-5 dias. Em quarto lugar, ao contrário de outro modelo ciliados, Stentor raramente entram em forma de cisto e eles não podem ser congelados.
Um aspecto importante de cultivo Stentor é a seleção de um organismo de alimentação adequada. Vários métodos para cultivo Stentor foram descritos anteriormente. Um deles sugere para usar leite desnatado para bactérias de cultura que alimentam então Stentor. Tal técnica é eficaz em cultivo Stentor; no entanto, aplicação de técnicas de genômicas requer amostras puras para evitar confusões resultantes de leituras genômicas de organismos comida indefinido. Usando o protocolo atual, Stentor podem ser cultivadas em massa e, porque a comida deles, Chlamydomonas, foi sequenciada, a presença de contaminação genômica do organismo comida pode ser detectada e controlada para. Por razões desconhecidas, o tártaro tinha que reabastecer seus estoques, retornando para onde ele encontrou Stentor antes. Com o protocolo atual, fomos capazes de manter Stentor por anos.
Experimentos de regeneração com Stentor são geralmente simples, mas existem alguns detalhes importantes para manter em mente. Em relação à seção 2, corte Stentor células ao meio podem ser dominadas em minutos. Dominar os procedimentos mais avançados Microcirurgia de Stentor pode exigir uma semana de treinos. Enquanto realizando um tratamento de sacarose ou de ureia (seção 3), se no início da imagem latente, a maioria das células ainda tem suas bandas membranellar, aumentar o tempo de incubação por 10-30 s para quando o tratamento de sacarose é executado em seguida. Não aumentam o tempo de tratamento de sacarose, além de incubação de 3 min porque ele irá resultar em morte celular.
Imagem de Stentor regeneração requer métodos de grandes células de imagem durante longos períodos de tempo. O método de imagem detalhado na seção 4 só pode ser usado com um microscópio vertical. Se um microscópio invertido está disponível, em vez disso, as células podem ser colocadas em um slide ou lamela em câmaras pequenas. Um método é criar uma câmara sem vaselina e cobrir com outra lamela para evitar a evaporação. Alternativamente, uma câmara para uma célula individual pode ser feita por fazer um buraco com um furador do tamanho desejado em um 1 x 1 cm2 quadrados de espaçador de silicone (tabela de materiais), colocação do espaçador em uma lamela, colocando as células na câmara e cobrindo a câmara com outra lamela. Quando a imagem, se não vai a orientação correta para observar as características de cada etapa de regeneração Stentor , toque a placa firmemente, para fazer o contrato de célula. Assistir a célula estender para identificar o estágio de regeneração (extensão completa leva cerca de 45 s). Se a célula estiver ainda na orientação errada, repita as batidas. As imagens mostradas na Figura 1 e Figura 6 foram tiradas por um microscópio estéreo zoom; no entanto, todos os experimentos detalhados podem ser executados usando um 5 X estéreo microscópio de dissecção.
Outro desafio além de cultivo e imaging Stentor é o rastreamento de regeneração, especificamente a quantidade de tempo necessário para identificar estágios. Se a regeneração celular está perfeitamente orientado com a região do primórdio oral claramente visível, a identificação do estágio leva alguns segundos. Às vezes, no entanto, a célula de Stentor é em uma orientação impedindo a clara atribuição de fase de regeneração, tendo assim mais tempo para identificar. A quantidade significativa de tempo necessário para a fase de regeneração de células individuais podem atrasar a quantificação de todas as células em regeneração, diminuindo assim a precisão temporal do estadiamento e exigir que o observador para esperar e refazer a imagem da célula depois mudou-se para uma nova orientação. Consequentemente, esta experiência é tanto tempo e trabalho intensivo. Por estas razões, seria altamente desejável para desenvolver métodos automatizados para detectar células Stentor e atribuição de estágios de regeneração em dados de vídeo microscopia. Estas também permitiria mais experimentos reprodutíveis, aumenta o tamanho da amostra e a remoção de viés humano.
O surgimento de métodos altamente sensíveis, genômicos e proteômica, começou-se a colocar estudos de células únicas em alcance. Para tais análises de célula única, o tamanho gigante de uma célula de Stentor torna desejável cobaia para experimentos de prova de conceito. Para tais experiências ser possível, cultivo Stentor é fundamental, e então os métodos descritos aqui devem desempenhar um papel no desenvolvimento de técnicas mais avançadas de célula única.

As células não são simples sacos de enzimas, mas prefiro altamente complexas máquinas cujos componentes são cuidadosamente dimensionados para o tamanho correto e dispostos em posições bem definidas. A morfogênese das células individuais representa um processo chave em biologia celular e do desenvolvimento, mas seu mecanismo molecular é desconhecido1,2. Enquanto algumas células cultivadas assemelham-se a bolhas, organismos unicelulares podem ter extremamente complicado arquiteturas, exemplificadas pelos complexos padrões corticais vistos em ciliados3,4.
Talvez o exemplo mais extremo de uma célula altamente estruturado é Stentor coeruleus, um heterotrichous gigante ciliados parente Tetrahymena e Paramecium. Stentor é de 1 mm de comprimento e é coberto com mais de 100 listras longitudinais de pigmento azul, alternando com fileiras de cílios organizados pelo paralelas pilhas de fitas de microtúbulos que correm o comprimento da célula inteira. A célula é trombeta-dadas forma (Figura 1), com uma banda de membranellar e um aparelho oral (OA) em sua extremidade anterior e um holdfast que atribui a célula ao substrato em sua extremidade posterior. Além da polaridade claro ântero-posterior, a célula também mostra uma distintiva padronização quiral, tal que o espaçamento entre linhas ciliares gradualmente aumenta no sentido horário. Isso resulta em uma descontinuidade onde se encontra com a linha mais estreita a linha mais ampla e esta região da superfície celular, conhecida como o locus de contraste de listra, pode induzir a formação do segundo conjunto de estruturas da extremidade anterior quando enxertado em outra cela5, tornando-se formalmente equivalente ao organizador de Spemann. Assim, todos os processos-chave da biologia do desenvolvimento tem seus análogos em Stentor: axiation, formação de padrão e indução. Em um embrião, estes processos são movidos por diferenças de destino entre células diferentes, mas no Stentor, eles devem ser conduzidos por destino as diferenças entre regiões diferentes dentro de uma única célula. O que define as diferenças entre as regiões dentro Stentor é um mistério.
Se qualquer parte de Stentor é cortado, a peça que faltava da célula pode regenerar para produzir uma célula normal em questão de horas. Se uma célula é cortado na metade, ou mesmo em pedaços muito pequenos, cada peça reorganiza em uma célula de aparência normal, mas menor e restaura adequada proporcionalidade entre célula peças6,7. Mesmo pequenos fragmentos, 1/64th o tamanho da célula original, são capazes de regenerar-se em uma célula pequena, mas normalmente proporcionada e então crescer para o tamanho6. Stentor , portanto, apresenta uma oportunidade única para estudar os mecanismos da organela tamanho dimensionamento e célula crescimento Regulamento usando métodos cirúrgicos que geralmente são aplicados a nível de tecidos ou organismos todo.
Uma das propriedades de Stentor que lhe permite regenerar-se de uma ampla gama de operações cirúrgicas é que ele contém um único noduladas Macronúcleo (Figura 1), com cerca de 50.000 cópias do genoma inteiro8. Enquanto um fragmento de célula contém pelo menos um nó macronuclear, tem a capacidade de se regenerar totalmente. Outra propriedade subjacente a capacidade de regeneração do Stentoré sua prodigiosa capacidade de cicatrização de feridas. Embora muitos tipos de células são capazes de curar suas feridas9, Stentor é capaz de recuperar-se de uma extraordinária gama de perturbações físicas. Um exemplo de recuperação de Stentor de uma perturbação drástica, juntamente com os métodos para a visualização fluxo citoplasmático em Stentor10 anteriormente foram relatadas. Estes métodos permitem o estudo do efeito de regeneração como ferindo e subsequentes o estado físico do citoplasma.
Stentordo enorme tamanho, capacidade de regeneração extraordinária e o fato de que ela se manifesta de muitos dos fenômenos do desenvolvimento vistos em embriões multicelulares (como organizadores, axiation e padronização) atraíram muitos biólogos do desenvolvimento durante a virada do século passado, incluindo Thomas Hunt Morgan7. Durante os anos 50 e 60, abordagens microcirúrgicos demonstraram uma variedade surpreendente de processos regenerativos e morfogenéticas neste organismo unicelular11. No entanto, Stentor foi desenvolvido como um sistema modelo de biologia molecular apenas recentemente. Durante os últimos anos, o genoma de Stentor foi sequenciado e montados8, e o método para perturbar a expressão gênica usando RNAi alimentando foi desenvolvido12.
Uma das razões que Stentor foi desenvolvido num organismo modelo para a moderna biologia molecular só recentemente foi a dificuldade de cultivar grandes culturas devido ao seu longo ciclo de célula (3 a 5 dias). No entanto, os métodos modernos de genômica e proteômica exigem menos material do que costumavam, e o volume de uma única célula de Stentor é suficiente para estes métodos, mesmo sem recorrer a métodos ultra-sensível que foram desenvolvidos para a análise do single células que são mais pequenas que Stentor. Secção 1 do protocolo detalha o procedimento para o estabelecimento de uma grande cultura de uma única célula de Stentor . A mesma abordagem pode ser usada para estabelecer uma grande cultura de um fragmento de célula obtida pelo corte de uma célula. Secção 1 também fornece as diretrizes para a manutenção saudável Stentor culturas durante longos períodos de tempo. Secção 2 do protocolo prevê que a metodologia de indução de regeneração celular cortando as células manualmente com uma agulha de vidro. Secção 3 do protocolo é dedicado a dois métodos de induzir a regeneração de estruturas celulares específicos (aparelhos de membranellar banda e oral): tratar as células com sacarose ou ureia conduz ao derramamento destas estruturas, seguido por seus regeneração. Secção 4 do protocolo detalha um método para o tratamento de imagens de regeneração de células individuais durante longos períodos de tempo. Secção 4 termina com a descrição dos estágios de regeneração e dicas sobre a análise da dinâmica de regeneração.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

As células precisam ser capazes de regenerar as partes para se recuperar de perturbações externas. Os ciliados unicelulares Stentor coeruleus é um organismo modelo excelente para estudar a cicatrização e regeneração celular subsequente. O genoma de Stentor tornou-se disponível recentemente, juntamente com métodos de biologia molecular moderna, tais como RNAi. Estas ferramentas possibilitam estudar regeneração de célula única a nível molecular. A primeira seção do protocolo abrange estabelecendo Stentor culturas de células de células únicas ou fragmentos de células, juntamente com as orientações gerais para a manutenção de culturas de Stentor . Cultivo de Stentor em grandes quantidades permite a utilização de ferramentas valiosas como bioquímica, sequenciamento e espectrometria de massa. As seções subsequentes do protocolo cobrem diferentes abordagens para a indução de regeneração em Stentor. Manualmente, cortando as células com uma agulha de vidro permite estudar a regeneração de partes de células grandes, enquanto o tratamento de células com sacarose ou ureia permite estudar a regeneração de estruturas específicas, localizadas na extremidade anterior da célula. Um método de imagem células individuais de regeneração é fornecido, juntamente com uma rubrica para encenar e analisar a dinâmica da regeneração. Todo o processo de regeneração é dividido em três fases. Visualizando a dinâmica da progressão de uma população de células através dos estágios, é demonstrada a heterogeneidade no calendário de regeneração.

Stentor culturas foram confiantemente estabelecidas e mantidas de células individuais ou fragmentos de células usando a secção 1 do protocolo. Um exemplo representativo de uma cultura saudável grande é mostrado no vídeo 1.
O curso de tempo de regeneração foi medido em Stentor , usando o método de tratamento de sacarose para iniciar a regeneração descrita no passo 3.1, combinado com a imagem e o método de análise, discutido na seção 4 (Figura 7). Este enredo indica que há uma propagação de uma hora de duração no tempo levado pela população de células para alcançar qualquer estágio particular. Este tipo de análise permite o estudo da heterogeneidade temporal no processo de regeneração em uma população de regenerar as células.
A seguir está um resumo de tempo de regeneração que tem sido observado até agora depois de dezenas de tratamentos de sacarose (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 é quando as células Stentor parecem lágrimas sem qualquer banda de membranellar (nesta fase começa imediatamente após o fracasso de sacarose). Este estágio dura de 3-6 h 2 fase é quando uma banda membranellar aparece e cresce (3-6 h após o tratamento de sacarose). Este estágio dura de 3-4 h.. fase 3 é quando um Primórdio oral aparece na extremidade posterior da banda membranellar (6-8 h após o tratamento de sacarose), e ambas as estruturas são movidas em direção a extremidade anterior da célula. Esta fase tem a duração de 1-2h. Quando tanto a banda membranellar e o aparelho oral alcançou a extremidade anterior da célula, isto indica a conclusão da regeneração. A célula adoptou a forma de trombeta-como característica Stentor . As células foram completamente regenerada 8-9h após tratamento de sacarose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Figura 1. Instantâneo de Stentor. A banda membranellar e os aparelhos orais são mostrados na extremidade anterior da célula. O holdfast está na extremidade posterior da célula. Stentor Macronúcleo é noduladas. Um bem alimentados Stentor tem verdes comida vacúolos contendo principalmente Chlamydomonas. Barra de escala é 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figura 2. Instalação de corte Stentor . Corte de célula é executada manualmente manipulando uma agulha de vidro enquanto olha para a célula, usando um microscópio estéreo dissecação comercialmente disponível. O propósito o lenço de papel é fornecer o fundo branco para ver melhor as células. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Figura 3. Instantâneos de vídeo 3 ilustrando como cortar um Stentor com uma agulha de vidro. (A) A Stentor imediatamente antes da agulha toca nela. (B) A Stentor suavemente espremido entre uma lâmina de vidro e agulha. (C) A contratada Stentor , reagindo à força da agulha. (D) A Stentor corte pressionando suavemente na célula com o lado da agulha. (E) A Stentor agora cortado em dois, mas não separados. Dois fragmentos de Stentor (F). Barra de escala é 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figura 4. Visualização esquemática da seção 3 e seção 4 do protocolo. Este é um protocolo ilustrado para a realização de sacarose ou tratamento de ureia e observação de regeneração celular. O tempo indicado no painel de fundo é medido desde o início da lavagem 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figura 5. A configuração para a observação de imagens e/ou direta de regeneração com um microscópio ereto. Em cada gota de µ l 4 pendurados em lamela, há uma célula em fase de regeneração. Água dos poços da placa de vidro local limita a evaporação das gotas. Esta configuração permite que após a regeneração de várias células em paralelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Figura 6. Instantâneos de Stentor em cada estágio da banda membranellar e a regeneração de aparelho oral. (A) estágio 1 é caracterizado por uma forma de lágrima, como celulares e a ausência da banda membranellar. (B) fase 2 caracteriza-se pelo aparecimento da banda membranellar, uma estrutura baseada em cílios que bate continuamente. Membranellar bandas são marcadas com linhas tracejadas brancas em painéis B - D. (C e D) estágio 3 é caracterizado pelo aparecimento do primórdio oral (marcado com uma seta). Primórdio oral parece uma invaginação na extremidade posterior da banda membranellar. O Primórdio oral então vai subir para a parte anterior da célula tornar-se o aparelho oral. (E) regeneração é concluída quando a célula tem adotado a característica forma de trombeta, como Stentor , e o aparelho bucal (marcado com uma seta) alargou-se na extremidade anterior da célula. Barra de escala é 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figura 7. Empilhado apresentando enredo de caixa como proporções de células em todas as fases da regeneração após tratamento de sacarose muda ao longo do tempo. A trama mostra a heterogeneidade no calendário dos estágios de regeneração dentro de uma população de células de regeneração. "Fim de reg." indica a conclusão da regeneração. O número de células: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Vídeo de 1. Exemplo de uma cultura saudável de Stentor . Geralmente, se uma cultura é concentrado, dividindo a cultura é recomendado. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Vídeo 2. A abrandar Stentor com metilcelulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Vídeo de 3. Corte Stentor. Células individuais podem ser cortadas manualmente em várias peças sob um estéreo microscópio de dissecção pressionando uma agulha de vidro através da célula. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema com cultura</td>
			<td>Possível solução</td>
			<td>Prevenção de possível</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura é oprimida por rotíferos ou outros organismos grandes.</td>
			<td>Remova tantos Stentor quanto possível, para uma nova placa de cultura. Em seguida lave as células três vezes.</td>
			<td>Lave Stentor quando recebê-los, mesmo quando compra-los de um fornecedor comercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura é oprimida por fungos ou outros organismos pequenos.</td>
			<td>Identificar um canto onde há o mínimo Stentor. Nessa área, remover a mídia tanto quanto possível, sem remover muitos Stentor e adicione novo PSW. Misture delicadamente mas completamente para distrubute os organismos invasores. Saltar a próxima refeição e o Stentor comerem.</td>
			<td>Observar a cultura regularmente e remover contaminantes pequenos através da troca de mídia para fresco PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor está deitado em cima um do outro.</td>
			<td>Dividi a cultura para que a concentração seja inferior a 20 células/mL.</td>
			<td>Dividir as culturas mais vezes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Células de Stentor estão acasalando.</td>
			<td>Alimente a cada 4 dias em vez da cada 5 dias.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>A cultura tem um monte de material escuro de resíduos.</td>
			<td>Retire o máximo do material escuro, resíduos de Stentor , quanto possível, sem retirar as células. Se Stentor são anexados ao material escuro, pipete acima e para baixo para liberar as células Stentor de seus resíduos e em seguida, remova a mídia com o lixo sem remover as células. Ou, remover aqueles Stentor e alimentar adequadamente menos.</td>
			<td>Alimentação Stentor 1ml menos comida por 100 mL de cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insalubre para o futuro (vacuolated/inchado ou arredondados) Stentor.
</td>
			<td>Remover mídia tanto quanto possível, sem remover muitas células Stentor e adicionar novo PSW.</td>
			<td>Troca a mídia regularmente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Guia de solução de problemas para cultivo Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

A gigante Ciliophora, Stentor coeruleus, é um excelente sistema para estudar regeneração e cicatrização de feridas. Apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de culturas de células de Stentor de células únicas ou fragmentos de células, induzindo a regeneração de células de corte, quimicamente, induzindo a regeneração da banda membranellar e aparelhos orais, imagem e análise de célula regeneração.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K visualizações.  University of California San Francisco. A gigante Ciliophora, Stentor coeruleus, é um excelente sistema para estudar regeneração e cicatrização de feridas. Apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de culturas de células de Stentor de células únicas ou fragmentos de células, induzindo a regeneração de células de corte, quimicamente, induzindo a regeneração da banda membranellar e aparelhos orais, imagem e análise de célula regeneração.

Vídeo: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Biologia do Desenvolvimento

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medicina

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neurociência

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biologia

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

<meta charset="utf8"></head><body>Um modelo murino padronizado de regeneração de tecidos moles induzida por terapia extracorpórea por ondas de choque

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Um modelo murino padronizado de regeneração de tecidos moles induzida por terapia extracorpórea por ondas de choque

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

A perfusão DiI como método de visualização vascular em<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Resumo

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