이 작품은 NIH R01 GM113602 (WFM) 보조금과 NSF 1144247 (알)에 의해 지원 되었다. 우리 인정 마크 Slabodnick 나탈리 커 클 랜드 이러한 프로토콜 중 일부의 초기 버전을 개발 하 고 유익한 토론 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 카 리 나 Perlaza 및 Greyson 루이스 감사합니다.

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저자는 공개 없다.

경작 Stentor 다양을 한 도전 선물 한다. 첫째, 세포의 많은 수를 필요로 하는 실험을 수행 하기 위해 하나 Stentor 농도 20 셀/mL을 초과 하면 건강에 해로운 될 문화로 Stentor 문화의 많은 수를 유지 해야 합니다. 둘째, 자주 Stentor 문화를 오염 수 생물 Stentor 보다 빠르게 분할 하 고 (일반적인 오염 물질은 rotifers) 문화를 압도. 따라서, 그것은 현미경으로 문화를 주기적으로 검사 하 고 오염 물질을 제거 하는 데 필요한입니다. 때때로, 새로운 문화는 오염 된 문화에서 수동으로 구출 하는 세포의 작은 숫자에서 시작 될 필요가 있다. 이 건강 한 Stentor 문화를 유지 하는 데 필요한 시간이 증가 합니다. 셋째, 단일 셀 400 mL 문화 확대 필요 합니다 적어도 한 달 Stentor 세포 주기는 3-5 일 때문에. 넷째, 다른 모델과 달리 ciliates Stentor 드물게 낭종에가 하 고 그들은 동결 수 없습니다 키를 누릅니다.
Stentor 경작의 중요 한 측면의 적절 한 음식 유 기체의 선택 이다. Stentor 경작을 위한 다양 한 방법은 설명 이전 했다. 그들 중 하나를 사용 하 여 탈지 우유 Stentor피드 박테리아 문화 제안 합니다. 이러한 기술은 Stentor; 경작에 효과적입니다. 그러나, 게놈 기술 응용 프로그램에서 정의 되지 않은 식품 생물 게놈 읽기에서 발생 하는 혼동을 피하기 위해 순수 샘플을 요구 한다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, Stentor 질량에서 성장 될 수 있다 고, 그들의 음식, Chlamydomonas, 시퀀싱 되었습니다 때문에 genomic 오염 식품 유기 체에서 존재 수 수 감지 제어. 알 수 없는 이유로 타르 타르 어디 그가 발견 하기 전에 Stentor 반환 하 여 그의 주식을 보충 했다. 현재 프로토콜 우리 Stentor 수년간 계속 할 수 있게 되었습니다.
Stentor 재생 실험은 일반적으로 간단 하지만 마음에 계속 몇 가지 중요 한 세부 사항. 섹션 2에 관한 Stentor 절단 절반 세포 분에 마스터 수 있습니다. 마스터링 Stentor 의 고급 미세 절차 연습 주가 필요할 수 있습니다. 동안 때 자당 치료 다음 수행 됩니다에 대 한 10-30에 의해 부 화 시간을 증가 (제 3), 영상 시작 되는 시점에 대부분 셀 아직도 있다면 그들의 membranellar 밴드 자당 또는 요소 처리를 수행. 3 분 보육 넘어 자당 치료의 시간 그것은 세포 죽음 귀 착될 것 이다 때문에 늘리지 마십시오.
Stentor 의 영상 재생 시간의 오랜 기간 동안 이미지 큰 셀에 방법을 필요 합니다. 섹션 4에 이미징 방법만 똑바로 현미경으로 사용할 수 있습니다. 거꾸로 현미경 대신 사용할 수 있는 경우, 셀 슬라이드 또는 작은 챔버에 coverslip에 배치할 수 있습니다. 한 가지 방법은 증발을 방지 하기 위해 다른 coverslip와 석유 젤리와 커버 챔버를 만드는 것입니다. 또는 개별 셀에 대 한 챔버 1 x 1 cm2 실리콘 스페이서의 평방에 원하는 크기의 구멍 펀치 구멍을 만들어 할 수 있다 (테이블의 재료)는 coverslip에는 스페이서를 배치, 셀 챔버 그리고 다른 coverslip와 챔버. 이미징, Stentor 중생의 각 단계의 특성을 관찰 하는 올바른 방향에 있지 않은 경우 때 셀 계약을 확고 하 게 접시를 누릅니다. 중생의 단계를 식별 하는 확장 셀 보고 (전체 확장 소요 약 45 s). 셀이 잘못 된 방향에 있는 아직도, 두드리는 반복 합니다. 그림 1 과 그림 6 에 표시 된 이미지는 스테레오 줌 현미경;로 찍은 그러나, 모든 실험 상세한 해 부 실체 현미경 X 5를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
경작 및 이미징 Stentor 외 또 다른 도전을 재생, 특히 단계를 식별 하는 데 필요한 시간의 양의 추적 이다. 완벽 하 게 명확 하 게 보이는 구두 primordium의 지역 중심 재생 셀 이면 무대의 몇 초 걸립니다. 그러나 가끔은,, Stentor 셀 재생 단계, 따라서 식별 하기 위해 더 많은 시간을 복용의 명확한 임무를 방지 하는 방향에서입니다. 상당한 양의 무대 개별 재생 셀 모든 재생 세포, 따라서 감소 하는 준비 하 고 기다려야 관찰자 요구의 시간 정밀도의 정량화를 지연 시킬 수 및 다시 후 셀 이동 이미지 하는 데 필요한 시간 새로운 방향입니다. 따라서,이 실험은 모두 시간과 노동 집약. 이러한 이유로, 그것은 매우 바람직한 Stentor 세포를 감지 하 고 비디오 현미경 데이터에는 중생의 단계 할당에 대 한 자동화 된 방법을 개발 하는 것입니다. 이들은 또한 더 재현 실험에 대 한 허용 샘플 크기와 인간의 편견의 제거에서 증가 한다.
매우 민감한 genomic와 proteomic 방법의 출현은 단일 세포의 연구 범위에 넣어 하기 시작 했다. 이러한 단일 세포 분석 Stentor 셀의 거 대 한 크기 네요 개념 증명 실험에 대 한 바람직한 테스트 주제. 가능, 같은 실험에 대 한 기본적, 이다 Stentor 경작 하 고 그래서 여기에 설명 된 방법을 더 고급 단일 셀 기술의 추가 개발 역할을 담당할 해야.

세포의 효소, 하지만 그 구성 요소는 신중 하 게 정확한 크기로 조정 하 고 잘 정의 된 위치에서 배열 오히려 매우 복잡 한 기계 간단한 가방 않습니다. 개별 셀의 morphogenesis 셀과 발달 생물학, 핵심 프로세스를 나타내지만 그것의 분자 메커니즘은 알 수 없는1,2. 동안 일부 교양된 셀 모양을 닮은, 단 세포 유기 체 수는 매우 복잡 한 아키텍처, ciliates3,4복잡 한 대뇌 피 질의 패턴에 의해 exemplified.
아마도 가장 극단적인 예를 고도로 구조화 된 셀의 거 대 한 heterotrichous ciliate Tetrahymena Paramecium 하 먼 관련 Stentor coeruleus, 이다. Stentor 길이 1 m m 이며 속눈썹 microtubule 리본 전체 셀의 길이 실행 하는 병렬 스택 주최의 행으로 교체 하는 블루 안료의 이상의 100 세로 줄무늬를 덮여 있다. 셀은 트럼펫-모양 (그림 1), membranellar 밴드와 그것의 앞쪽 끝과 후부 끝 기판에 셀 연결 holdfast 구강 장치 (OA). 분명 이전 후부 극성 외 셀 또한 보여줍니다 독특한 랄 패턴화 속눈썹 행 사이의 간격 점차적으로 시계 방향으로 증가 되도록. 불연속 좁은 행 만나는 넓은 행 및 셀 표면에의이 지역에서에서이 결과 스트라이프 대비의 소재 시로 알려진, 앞쪽 끝 구조에 다른 셀5, 융합 때의 두 번째 세트의 형성을 일으킬 수 있다 공식적으로 Spemann의 조직자에 해당 하 고 있습니다. 따라서, 개발 생물학의 모든 주요 프로세스에 있는 그들의 아날로그 Stentor: axiation, 패턴 형성, 그리고 유도. 배아, Stentor다른 세포 사이 에서도 이러한 프로세스 운명 차이 의해 구동 됩니다, 그리고 그들은 운명 단일 셀 내의 다른 지역 간의 차이 의해 구동 되어야 합니다. 무슨 Stentor 내에서 지역 간의 차이점을 정의 신비 이다.
Stentor 의 일부 차단 하는 경우 셀의 푸는 시간에 정상적인 세포를 재생할 수 있습니다. 셀 경우 절반, 또는 훨씬 더 작은 조각으로 심지어 각 조각 정상 찾고 하지만 작은 셀으로 재구성 하 여 잘라내어 셀 부품6,7사이의 적절 한 비례를 복구. 심지어 작은 조각, 1/64번째 원래 셀의 크기는 작지만 일반적으로 잡힌 셀으로 다시 생성 하 고 다음 전체 크기6성장 수 있습니다. Stentor 따라서 세포 기관이 크기 스케일링 및 세포 성장 규제의 조직 또는 전체 유기 체 수준에 일반적으로 적용 되는 수술 방법을 사용 하 여 기계 장치를 공부 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
Stentor 수술 작업의 넓은 범위에서 재생성 하 수의 속성 중 하나는 단일 nodulated macronucleus (그림 1)8전체 게놈 약 50000 사본을 포함입니다. 셀 조각 macronuclear 노드를 하나 이상 포함, 그것은 완벽 하 게 다시 생성 하는 기능. Stentor의 재생 능력을 기본 또 다른 재산의 막대 한 상처 치유 능력 이다. 많은 세포 유형9그들의 상처 치유 할 수 있다, 비록 Stentor 물리적 섭의 특별 한 범위에서 복구할 수 있다. Stentor10 세포질 흐름을 시각화 하는 방법 함께 과감 한 섭 동에서 Stentor 복구의 예로 이전 보고 되었다. 이러한 메서드는 세포질의 물리적 상태 어떻게 부상 하 고 이후 재생 영향의 연구를 수 있습니다.
Stentor의 거 대 한 크기, 특별 한 재생 능력, 그리고 사실 (예: 조직, axiation, 및 패턴화) 다세포 배아에서 발달 현상의 많은 명단 매력 중 많은 발달 생물학 토머스 헌트 모건7을 포함 하 여 지난 세기의 켜십시오. 50 년대와 60 년대 동안 microsurgical 접근 입증이 단 세포 유기 체11에서 재생 및 전체적 프로세스의 놀라운 배열. 그러나, Stentor 개발 되었습니다 분자 생물학 모델 시스템으로 최근에. 지난 몇 년 동안 Stentor 의 게놈 시퀀싱은8, 조립 하 고 먹이로 RNAi를 사용 하 여 유전자 발현을 교란 하는 방법은 개발된12살.
Stentor 현대 분자 생물학만을 위한 모형 유기 체에 개발 되었다 이유 중 하나는 최근 성장 때문에 그것의 긴 세포 주기 (3 ~ 5 일) 큰 문화의 어려움 이었다. 그러나 현대 genomic와 proteomic 방법 그들은, 사용 하 고 단일 Stentor 셀의 볼륨은 단일의 분석을 위해 개발 된 磁 방법에의 지 없이 이러한 방법에 대 한 충분 한 보다 더 적은 물자를 요구 하는, 셀 Stentor보다 훨씬 작은. 프로토콜의 섹션 1 단일 Stentor 셀에서 큰 문화를 설정 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 동일한 접근 셀 절단에 의해 얻은 세포 조각에서 큰 문화 확립을 사용할 수 있습니다. 섹션 1은 또한 시간의 오랜 기간 동안 건강 한 Stentor 문화를 유지 하기 위한 지침을 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 2 유리 바늘으로 셀을 수동으로 절단 하 여 세포 재생을 유도 대 한 방법론을 제공 합니다. 특정 셀 구조 (membranellar 밴드와 구강 장치)의 재생을 유도 하는 두 가지 방법에 전념 하는 프로토콜의 제 3: 다음 이러한 구조를 흘리기 이끌어 자당 또는 요소 셀 치료 그들의 재생입니다. 프로토콜의 제 4 시간의 오랜 기간 동안 개별 재생 세포의 영상에 대 한 방법을 자세히 설명합니다. 제 4 단계의 중생과 중생 역학의 분석에 대 한 도움말의 설명으로 끝납니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

셀은 외부 섭에서 회복 하기 위해 그들의 부분을 다시 생성할 수 있이 필요가 있다. 단 세포 ciliate Stentor coeruleus 는 상처 치유 공부에 우수한 모델 유기 체 및 후속 세포 재생입니다. Stentor 게놈 최근, RNAi 등 현대 분자 생물학 방법을 함께 제공 되었다. 이러한 도구는 단일 세포 재생 분자 수준에서 연구를 가능 하 게. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 단일 셀 또는 셀 조각 Stentor 문화를 유지 하는 것에 대 한 일반 지침과 함께 수립 Stentor 셀 문화를 다루고 있습니다. 생화학, 시퀀싱, 그리고 질량 분석 같은 유용한 도구를 사용 하 여 대량에서 Stentor 경작 할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 섹션 커버 Stentor재생을 유도 하는 다른 접근 방식. 수동으로 유리 바늘으로 세포를 절단 셀의 앞쪽 끝에 있는 특정 구조의 재생을 공부 하 고 수 자당 또는 요소 셀 치료 큰 셀 부품의 재생을 공부 수 있습니다. 이미징 개별 재생 셀에 대 한 방법은 준비 하 고 중생의 역학 분석 표제와 함께 제공 됩니다. 중생의 전체 과정은 3 단계로 분할 된다. 시각화의 진행 단계를 통해 세포의 인구 역학, 여 재생 타이밍에이 증명 됩니다.

Stentor 문화를 안정적으로 설립 하 고 개별 셀 또는 셀 조각을 사용 하는 프로토콜의 섹션 1에서 유지 되었습니다 있다. 큰 건강 한 문화에 대 한 대표적인 예제 비디오 1에 표시 됩니다.
중생의 시간 과정 Stentor 시작 단계 3.1, 이미징 및 제 4 (그림 7)에서 설명 하는 분석 방법에서에서 설명 하는 재생에 대 한 자당 치료 방법을 사용 하 여 측정 했다. 이 음모는 어떤 특정 단계에 도달 하 셀의 인구에 의해 걸린 시간에서 한 시간 동안 확산 임을 나타냅니다. 이러한 유형의 분석 셀 회생의 인구에서 재생성 과정에서 시간적이의 연구를 수 있습니다.
다음은 지금까지 수십 자당 치료 (그림 4 및 그림 6) 후 관찰 되었습니다 재생 타이밍의 요약 이다. (이 단계는 자당 희미하게 직후 시작) 어떤 membranellar 밴드 없이 눈물 처럼 Stentor 셀 1 단계 때. 이 단계는 3-6 h. 단계 2는 membranellar 밴드 나타나고 (자당 치료 후 3-6 h) 성장 하는 때 지속 된다. 이 단계는 3-4 h. 3 단계 구강 primordium membranellar 밴드 (자당 치료 후 6-8 h), 후부 끝에 나타나고 두 구조는 셀의 앞쪽 끝으로 이동 하는 경우에 대 한 지속. 이 단계는 1-2 시간 지속 된다. Membranellar 밴드와 구강 장치 셀의 앞쪽 끝에 도달 하면,이 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 특성 Stentor 트럼펫 모양을 채택 했다. 셀 자당 치료 후 완전히 거듭난된 8-9 h를 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> 그림 1입니다. 스냅숏 Stentor의. Membranellar 밴드와 구강 장치는 세포의 앞쪽 끝에 표시 됩니다. holdfast 셀의 후부 끝 이다. Stentor macronucleus nodulated입니다. 잘 먹이 Stentor 녹색 식품 그들 주로 Chlamydomonas를 포함 하는. 눈금 막대는 0.5 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> 그림 2입니다. Stentor 절단 설정. 셀 절단 수동으로 상용 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 셀을 보는 동안 유리 바늘을 조작 하 여 수행 됩니다. 티슈 페이퍼의 목적은 흰색 배경에 더 나은 셀 참조를 제공 하는 것입니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> 그림 3입니다. 비디오 3 유리 바늘 Stentor 를 잘라 하는 방법을 보여주는 스냅샷. (A) A Stentor 직전 바늘 접촉 그것. (B) A Stentor 바늘과 유리 슬라이드 사이 부드럽게 압착. (C) A 계약 Stentor 바늘의 힘에 반응. (D) A Stentor 눌러 부드럽게 셀에 바늘의 측면으로 절단 되 고 (E) A Stentor 하지만 지금 두 잘라 분리 되지 않는다. (F) 두 개의 Stentor 파편. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> 그림 4입니다. 제 3과 제 4 프로토콜의 구조 시각화. 이것은 자당 또는 요소 치료 및 세포 재생의 관찰을 수행 하기 위한 그림된 프로토콜 이다. 하단 패널에 표시 된 시간 세척 1의 시작에서 측정 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> 그림 5입니다. 똑바로 현미경으로 중생의 이미징 및 직접 관찰에 대 한 설정. 각 4 µ L 드롭릿은 coverslip에서 매달려, 한 세포 재생을 겪고 있다. 유리 자리 접시의 우물에 물 방울의 증발을 제한합니다. 이 설정을 동시에 여러 세포의 재생에 따라 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> 그림 6입니다. Membranellar 밴드와 구강 장치 재생의 각 단계에서 Stentor 의 스냅샷. 1 단계 (A) 눈물 모양의 셀 모양 및 membranellar 밴드의 부재에 의해 특징입니다. (B) 단계 2 속눈썹 기반 구조를 지속적으로 뛰는 membranellar 밴드의 외관 특징 이다. Membranellar 밴드 패널 B에에서 흰색 파선으로 표시 됩니다-디 (C, D) 3 단계 구강 primordium (화살표 표시)의 외관에 의해 특징입니다. 구두 primordium membranellar 밴드의 뒤 끝에는 invagination 처럼 보인다. 구두 primordium 됩니다 다음 구강 장치 될 셀의 앞쪽을 향해 이동 합니다. (E) 재생 셀 Stentor 트럼펫 모양, 특성을 채택 했다 하 고 구강 장치 (화살표 표시) 셀의 앞쪽 끝에서 확대가 완료 됩니다. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> 그림 7입니다. 스택 상자 플롯 표시 어떻게 자당 치료 후 재생의 모든 단계에서 세포의 비율 시간이 지남에 변경. 음모 재생 세포의 인구 내의 재생 단계의 타이밍에서이 보여 줍니다. "최종 등록" 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 개수: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> 비디오 1입니다. 건강 한 Stentor 문화의 예. 일반적으로, 문화는 집중, 문화를 나누는 것이 좋습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> 비디오 2입니다. 스와 Stentor 늦추고. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> 비디오 3입니다. 절단 Stentor. 개별 셀 수동으로 스테레오 현미경 셀 통해 유리 바늘을 눌러 해 부 아래 여러 조각으로 잘릴 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문화에 대 한 문제</td>
			<td>가능한 치료</td>
			<td>가능한 예방</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 rotifers 또는 다른 큰 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>새로운 문화 접시에 가능한 많은 Stentor 를 제거 합니다. 다음 셀 세 번 세척.</td>
			<td>상용 공급 업체에서 구입 하는 경우에, 그들을 받을 때 Stentor 를 철저히 씻으십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 곰 팡이 또는 다른 작은 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>식별 코너는 최소한 Stentor. 그 지역에서 많은 Stentor 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW에 추가 합니다. 섞어 부드럽게 하지만 완전히 distrubute에 침입 유기 체. 다음 먹이 생략 하 고 Stentor 그들을 먹을 것 이다.</td>
			<td>문화를 정기적으로 관찰 하 고 신선한 PSW에 대 한 미디어를 교환 하 여 작은 오염 물질을 제거.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 서로 위에 누워 있다.</td>
			<td>농도 20 셀/mL 문화를 분할.</td>
			<td>더 자주 문화를 분할.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 셀 결합 됩니다.</td>
			<td>5 일 마다 대신 4 일 마다 피드.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 어두운 폐기물의 많은 있다.</td>
			<td>어두운 소재, 셀을 제거 하지 않고 가능한 Stentor 폐기물의 제거. Stentor 어두운 소재에 장착 하는 경우 위쪽 및 아래쪽으로 그들의 낭비에서 Stentor 세포를 다음 셀을 제거 하지 않고는 쓰레기와 함께 미디어를 제거 플라스틱. 또는, 그 Stentor 제거 하 고 그에 따라 피드 덜.</td>
			<td>피드 Stentor 음식 문화의 100 mL 당 적은 1 mL.</td>
		</tr>
<tr>
<td>유해한 수준의 vacuolated/비 대 한 (둥근) Stentor.
</td>
			<td>많은 Stentor 세포를 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW를 추가 합니다.</td>
			<td>미디어를 정기적으로 교환 합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Stentor경작에 대 한 문제 해결 가이드입니다.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Stentor 에 중생의 연구 방법

거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.6K 조회수.  University of California San Francisco. 거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

비디오: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

연구

발생학

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도<em&gt; Nematostella의 vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

의학

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

신경과학

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

생물학

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor 에 중생의 연구 방법

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코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도

재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

혈관 시각화를위한 DiI 관류

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석