Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
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この作品は、NIH グラント R01 GM113602 (WFM) と NSF 1144247 (AL) によって支持されました。我々 は、有益な議論では、これらのプロトコルのいくつかの初期のバージョンを開発するため、マーク Slabodnick とナタリー カークランドを認めます。原稿の批判的な読み、カリーナ Perlaza とグレイソン ・ ルイスに感謝します。

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	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ラッパムシを養殖の課題の数を示します。多数のセルを必要とする実験を実行するまず、ラッパムシ濃度 20 セル/mL を超えると不健康になる文化としてラッパムシ文化の多数を維持するためにであります。第二に、しばしばラッパムシ文化を汚染できる生物はラッパムシより分割し、(一般的な汚染物質はワムシ) 文化を圧倒します。したがって、顕微鏡下で培養を定期的に検査し、汚染物質を除去する必要は。時折、新しい文化は、汚染された文化から手動で救出された細胞の数が少ないから開始する必要があります。これは健康ラッパムシ文化を維持するために必要な時間が増加します。第三に、単一のセルを 400 mL 文化に進出と、ラッパムシ細胞周期は 3-5 日ために、少なくとも 1 ヶ月を必要です。第四に、他のモデルとは異なりと嚢胞フォームに繊毛虫ラッパムシ稀に凍結することはできません。
ラッパムシを養殖の重要な側面は、適切な食品の有機体の選択です。ラッパムシを培養するためのさまざまな方法が説明しました。それらの 1 つは、ラッパムシを供給するバクテリアを培養するスキムミルクを使用するように提案します。このような手法は養殖ラッパムシ; 効果的です。しかし、ゲノム技術のアプリケーションでは、未定義の餌生物からゲノムの読み取りによる混乱を避けるために純粋なサンプルが必要です。現在のプロトコルを使用して、ラッパムシを大量に育てることができる、彼らの食糧、クラミドモナスが配列されているので食品有機体からの遺伝子汚染の存在することができます検出および制御します。未知の理由のため歯石を前にラッパムシを見つけた彼に戻って彼の在庫を補充するために持っていた。現在のプロトコルでは、長年ラッパムシを維持できました。
ラッパムシ再生実験は一般に簡単ですが、留意すべきいくつかの重要な詳細があります。ラッパムシを切断に関してセクション 2 分で半分のセルを習得できます。ラッパムシのより高度な手術の手順をマスターすると、1 週間練習が必要があります。一方、スクロース処理が次に実行されるときの 10-30 s インキュベーション時間を増やす蔗糖あるいは尿素治療 (セクション 3)、イメージングの初めにほとんどの細胞はまだ自分たちの membranellar のバンドがある場合を実行します。それは細胞死になりますので 3 分インキュベーションを超えてスクロース処理の時間を増やさないでください。
ラッパムシの画像再生時間の長い期間にわたって大型細胞をイメージする方法が必要です。セクション 4 で詳細なイメージング法は、正立型顕微鏡でのみ使用できます。倒立顕微鏡が利用できる代わりに、スライドまたは小型チャンバーの coverslip のセルが配置できます。1 つの方法は、蒸発を防ぐために別の coverslip でワセリンとカバーの商工会議所を作成します。1 × 1 cm2のシリコン スペーサーの正方形で希望のサイズの穴を開けると穴を作るで、個々 のセルの商工会議所または、可能 (材料表)、観察にスペーサーを配置すること、商工会議所のセルを置くこと、と別の coverslip の商工会議所をカバーします。ラッパムシは、再生の各段階の特徴を観察する向きが正しいされていない場合、イメージング、携帯契約させるしっかりとプレートをタップします。細胞の再生の段階を識別するために拡張を見る (完全な拡張は約 45 秒)。間違った方向のセルでは、タップを繰り返します。図 1と図 6に示すように画像が撮影されたステレオ ズーム顕微鏡;ただし、詳細すべての実験は、実体顕微鏡を切り裂く X 5 を使用して実行できます。
養殖やラッパムシをイメージング以外の別の挑戦再生、特に段階を識別するために必要な時間の量の追跡であります。再生細胞がはっきりと見える口腔原基の領域と完全に指向の場合、ステージの同定は数秒をかかります。場合によっては、ただし、ラッパムシセルがので識別するより多くの時間を割いて、再生段階の明確な割り当てを防止する方向で。再生細胞が待機するオブザーバーを必要とするステージングの時間精度の減少、すべての再生細胞の定量を遅れる可能性がありますステージとイメージを再作成後にセルに移動に必要な時間のかなりの量新しい向き。したがって、この実験は時間と労力がかかりました。これらの理由から、ラッパムシ細胞を検出し、ビデオ顕微鏡検査データの再生の段階を割り当てるのための自動方法を開発する非常に望ましいでしょう。これらはまたより多くの再現実験に、サンプル サイズ、および人間バイアスの除去で増加します。
高感度の genomic および proteomic 方法の出現は、リーチに単一細胞の研究を入れてし始めています。このような単一細胞解析のラッパムシセルの巨大なサイズ概念実証実験のため、望ましいテストの対象になります。可能にするそのような実験のためラッパムシの養殖が、基本で、ここで説明する方法より高度な単一セル技術の更なる発展に役割を果たすべきので。

細胞は、酵素ではなく非常に複雑な機械要素を慎重に適切なサイズにスケールおよび明確に定義された位置に配置がシンプルなバッグではありません。個々 の細胞の形態形成は、細胞・発生生物学の重要なプロセスを表しますが、その分子機構は不明な1,2。いくつかの培養細胞塊に似ている、その単細胞生物に、非常に複雑なのアーキテクチャ、繊毛虫3,4に見られる複雑な皮質パターンに代表される持っていることができます。
おそらく高度な構造セルの最も極端な例は、巨大な heterotrichous の繊毛虫テトラヒメナゾウリムシのの遠縁ラッパムシ、です。ラッパムシ1 mm 長いは、セル全体の長さが実行される微小管リボンの並列スタック主催繊毛の行交互青色色素の以上 100 の縦ストライプで覆われます。セルはトランペット形 (図 1)、membranellar バンドとその前方の端と後部で基板にセルをアタッチ ホールドファスト口腔装置 (OA)。クリア前後極性に加えて、セルは間隔毛様体行徐々 に時計回りの方向に増加するように独特のキラル パターニングも示しています。これは、結果、狭い行が最も幅の広い行およびセル表面のこの地域を満たす不連続に前方構造別セル5、接ぎ木の 2 番目のセットの形成を誘導することができますストライプのコントラストの軌跡として知られ、正式のオーガナイザーと同等となっています。したがって、発生生物学のすべての主要プロセスは、ラッパムシの類似をある: axiation、パターン形成と誘導。胚、ラッパムシは異なる細胞の間、これらのプロセスが運命の違いによって駆動される、彼らは単一のセル内の異なる領域の運命の違いによって駆動される必要があります。ラッパムシの内の領域の違いを定義するものは謎です。
ラッパムシの任意の部分が途中で切れている場合、セルの行方不明の部分は時間の問題で正常な細胞を生成する再生成できます。セルがある場合で、各部分の半分、あるいははるかに小さい部分にカット普通しかし小さい細胞に再編成し、セル部品6、7の間に適切な比例を復元します。小さな断片、1/64th元のセルのサイズが小さいが均整通常細胞として再生して、フル サイズ6にすることができます。ラッパムシは、こうしての通常の組織または個体レベルで適用される手術方法を使用して細胞器官サイズ スケーリングと細胞成長調節機構を研究するユニークな機会を示します。
ラッパムシ手術操作の広い範囲から再生成することができますのプロパティの 1 つは8の全体のゲノムの約 50,000 枚とシングル着生大核 (図 1) が含まれていることです。細胞断片にゾウリムシの少なくとも 1 つのノードが含まれている限り、それは完全に再生成する能力を持ってください。ラッパムシの再生能力の基になる別のプロパティは、その驚異的な創傷治癒能力です。多くの細胞のタイプが9自分の傷の治癒が可能、ラッパムシは物理的な摂動の異常な範囲から回復することができます。以前ラッパムシ10で細胞質流動を可視化する方法とともに、抜本的な摂動からラッパムシ復旧の例は報告されなかった。これらのメソッドによりどのように負傷とそれに続く再生の影響の研究、細胞の物理的な状態。
ラッパムシの巨大なサイズ、異常な再生能力と、それが多細胞の胚 (主催者、axiation、パターニングなど) に見られる発達現象の多くをマニフェスト実際集めて中に多く発達生物学者トーマス ・ ハント ・ モーガンの7を含む最後の世紀の変わり目。50 年代、60 年代の間には、顕微鏡下の方法は、この単一 celled の有機体11の再生・形成過程の驚くべき配列を紹介されて。ただし、ラッパムシ最近開発された分子生物学モデル システムとしてのみ。過去数年、ラッパムシのゲノムは配列された、8を組み立て、餌で RNAi を用いた遺伝子発現を摂動する術が開発した12。
ラッパムシは現代分子生物学のみのモデル生物にした理由の一つは最近成長の長い細胞周期 (3 ~ 5 日) による大規模な文化の難しさがあった。ただし、現代の genomic および proteomic 方法ラッパムシ単細胞のボリュームは単一の分析のために開発された超高感度の方法に頼ることがなく、これらのメソッドは、十分な彼らには使用より少ない材料が必要ラッパムシよりはるかに小さいされているセル。プロトコルのセクション 1 は、単一のラッパムシセルから大規模な文化を確立するための手順を詳しく説明します。セルを切断して得られる細胞片から大規模な文化を確立する同じ方法を使用することができます。セクション 1 は、時間の長い期間にわたって健康ラッパムシ文化を維持するためのガイドラインを提供します。プロトコルのセクション 2 は、ガラス針で細胞を手動で切断することによって細胞の再生を誘導するための方法論を提供します。プロトコルのセクション 3 は特定のセル構造体 (membranellar バンドと口腔装置) の再生を誘導する 2 つの方法に捧げられて: 続いて、これらの構造の脱落につながる蔗糖あるいは尿素とセルを扱う、再生。プロトコルのセクション 4 では、時間の長い期間にわたって個々 の再生細胞のイメージング法を詳しく説明します。セクション 4 は、再生と再生のダイナミクスの解析のヒントの段階の説明で終わります。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

セルは外部摂動から回復するためのパーツを再生することができる必要があります。単細胞の繊毛虫ラッパムシ創傷治癒研究に優秀なモデル生物とそれに続く細胞の再生です。ラッパムシゲノム RNAi などの現代分子生物学方法と共に最近では、利用可能になった。これらのツールは、分子レベルで単一細胞の再生を検討することが可能。プロトコルの最初のセクションは、単一細胞または細胞の断片、ラッパムシ文化を維持するための一般的なガイドラインに沿ってからの培養細胞確立ラッパムシをカバーしています。ラッパムシを大量に養殖生化学、シーケンシング、および質量分析のような貴重なツールを使用することができます。プロトコルの後続のセクションはカバーラッパムシの再生を誘導するさまざまなアプローチです。ガラス針で細胞を手動で切断には、セルの前にある特定の構造の再生を勉強できます蔗糖あるいは尿素とセルを扱う大細胞部品の再生を勉強することができます。イメージング細胞再生の方法は、ステージングおよび再生のダイナミクスを分析するためのルーブリックと共に提供されます。再生の全体のプロセスは 3 つの段階に分かれています。進行の段階を経て細胞の人口の動態を可視化、再生タイミングで不均一性を発揮します。

ラッパムシ文化は確実に確立し、個々 のセルまたはプロトコルのセクション 1 を使用してセルのフラグメントから維持されます。ビデオ 1に大きい健全な文化の代表的な例を示します。
再生の時間コースラッパムシステップ 3.1、イメージングとセクション 4 (図 7) で説明する分析方法に記載されている再生を開始するためショ糖治療法を使用して測定しました。このプロットは、任意の特定のステージに到達する細胞の人口によって撮影時間 1 時間広がりがあることを示します。このタイプの解析は、細胞の再生の人口の再生過程における的不均一性の研究をことができます。
(図 4および図 6) ショ糖治療の数十の後これまで観察されている再生タイミングの概要は以下です。ステージ 1 は、ラッパムシセル (この段階はショ糖ウォッシュ アウトした直後に開始)、membranellar 帯なし涙のようです。このステージ 3 6 h. ステージ 2 は membranellar バンド表示 (スクロース処理後 3-6 時間) の成長と続きます。3-4 秀ステージ 3 は経口原基が membranellar バンド (スクロース処理後 6-8 時間) の後部の端に表示され、セルの前の終わりの方の両方の構造を移動するときこの段階続きます。この段階は、1-2 時間続きます。Membranellar バンドと口腔装置細胞の前端に達する、これは再生の完了を示した。セルは、特徴的なラッパムシラッパのような形状を採用しています。セルは、スクロース処理後 8-9 h を完全に再生されたのでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> 図 1。ラッパムシのスナップショット。Membranellar バンドと口腔装置は細胞の前方の端に表示されます。止め金はセルの後部端に。ラッパムシ大核が着生します。よく供給ラッパムシは大抵クラミドモナスを含む緑の食胞。スケール バーは 0.5 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> 図 2。ラッパムシ切断設定します。セル切断、市販解離性ステレオ顕微鏡を用いた細胞を見ながらガラス針を手動で操作することによって実行されます。ティッシュ ペーパーの目的より良いセルを表示する白い背景を提供することです。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> 図 3。ガラス針でラッパムシをカットする方法を示すビデオ 3 のスナップショット。(A) Aラッパムシ針がそれに触れる前にすぐに。(B) Aラッパムシは針とガラス スライド間優しく圧迫。(C) 契約ラッパムシ針の力に反応しています。(D) Aラッパムシ軽く針の側面とセルを押すカットされています。(E) Aラッパムシは今 2 つのカットが、区切られていません。(F) 2 つのラッパムシのフラグメント。スケール バーは 0.25 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> 図 4。セクション 3 とプロトコルのセクション 4 のスケマティック可視化。ショ糖や尿素処理や細胞の再生の観察を行うための図解プロトコルです。下部のパネルに示されている時刻は、洗って 1 の先頭から測定されます。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> 図 5。正立型顕微鏡を用いた再生のイメージングおよび/または直接観察のためセットアップします。それぞれ 4 μ L の液滴は、coverslip からぶら下がって、再生を受けている 1 つのセルがあります。スポット ガラスの井戸の水は、水滴の蒸発を制限します。このセットアップは、次の並列で複数の細胞を再生できます。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> 図 6。ラッパムシの membranellar バンドと口腔装置再生の各段階でスナップショット。(A) ステージ 1 はティア ドロップのような細胞の形態と membranellar バンドの不在によって特徴付けられます。(B) 第 2 段階は、membranellar バンド、継続的に打つ繊毛ベースの構造の外観が特徴です。パネル B の白い破線が付いている Membranellar バンド - D (C と D) ステージ 3 は経口原基 (矢印でマーク) の出現によって特徴付けられます。経口原基は membranellar バンドの後端で、陥入のように見えます。口腔の原基は、口腔装置になること、セルの前方に向かって移動されます。セルは特性ラッパムシラッパのような形状を採用し、口腔装置 (矢印でマーク) がセルの前方終わりに拡大している (E) 再生が完了します。スケール バーは 0.25 mm です<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> 図 7。ボックス プロット表示をスタック スクロース処理後の再生のすべての段階における細胞の割合がどのように変化する時間をかけています。プロットは、再生細胞の人口内の再生段階のタイミングで不均一性を示しています。「登録終了」は、再生完了を示します。セル数: 28。<a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> ビデオ 1。健全なラッパムシ文化の例。一般的に、文化は集中して、文化の分割お勧めします。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> ビデオ 2。セルロースと減速しラッパムシ。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> 動画 3.切削ラッパムシ。個々 のセルは、セルを介してガラス針を押すことによって顕微鏡を切り裂くステレオの下の複数の部分に手動でカットすることができます。<a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>文化の問題</td>
			<td>可能な治療</td>
			<td>可能な限り予防</td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、ワムシや他の大規模な生物によって圧倒されます。</td>
			<td>新しい培養皿にできるだけ多くラッパムシを削除します。セルを 3 回洗います。</td>
			<td>商業製造者から購入する場合でも、メッセージを受信するとき、ラッパムシを徹底的に洗います。</td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、真菌や他の小さい有機体によって圧倒されます。</td>
			<td>角を識別するが、少なくともラッパムシ。その地域で多くラッパムシを削除せず、可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW で追加します。ミックス優しくしかし徹底的 distrubute に侵入した微生物。次の授乳をスキップして、ラッパムシはそれらを食べる。</td>
			<td>文化を定期的に観察し、新鮮な PSW のメディアを交換することによって小さい汚染物質を削除します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ラッパムシは互いの上に置くこと。</td>
			<td>濃度は細胞/ml 未満 20 文化を分割します。</td>
			<td>多くの文化を分割します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ラッパムシ細胞交尾します。</td>
			<td>5 日ではなく 4 日ごとをフィードします。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>文化は、暗い廃棄物のたくさんを持っています。</td>
			<td>多くの暗い材料、セルを削除せずに、できるだけ、ラッパムシ廃棄物として削除します。ラッパムシは、暗い材料に添付されている場合、は、廃棄物からラッパムシセル、セルを削除せず廃棄物をメディアを取り外します上下ピペットします。または、それらのラッパムシを削除し、それに応じてフィードより少ない。</td>
			<td>フィードのラッパムシ以下の食品文化の 100 mL あたり 1 mL。</td>
		</tr>
<tr>
<td>不健康な探して (胞/肥大化または丸みを帯びた)ラッパムシ。
</td>
			<td>ラッパムシ細胞の多くを削除せず可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW を追加します。</td>
			<td>定期的にメディアを交換します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。ラッパムシを培養するためのトラブルシューティング ガイド。

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

ラッパムシの再生の研究のための方法

巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar バンドと口腔装置、イメージング、およびセルの分析の再生を誘導するための手順を提案します。再生。

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K ビュー.  University of California San Francisco. 巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar バンドと口腔装置、イメージング、およびセルの分析の再生を誘導するための手順を提案します。再生。

ビデオ: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

発生生物学

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

再狭窄の研究のための頸動脈内ステント留置のマウスモデル

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

医学

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

神経科学

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

プラナリアの固定化、部分照射し、組織移植

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

生物学

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

血管視覚化のためのDiI灌流<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

ラッパムシの再生の研究のための方法

要約

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スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導

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アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

血管視覚化のためのDiI灌流

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