Das demonstrierte Dissoziationsprotokoll für Pankreasgewebe ist einfach und bietet ein Werkzeug zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen aus Pankreasgewebe in verschiedenen Stadien des Malignitätsprozesses, einschließlich solider Tumore. Die Wiederherstellung intakter und lebensfähiger Azinuszellen ist eine große Herausforderung. Das Protokoll kann lebensfähige Einzelzellen aus normaler Bauchspeicheldrüse, Bauchspeicheldrüse mit prämalignen Läsionen oder Bauchspeicheldrüsentumoren mit zahlreichen Stroma- und Immunzellen gewinnen.
Die Verwendung dieses Protokolls zur Untersuchung menschlicher Bauchspeicheldrüsentumore oder entzündeter Bauchspeicheldrüsen könnte bei der Untersuchung dieser Krankheiten helfen, um neue Biomarker und Behandlungen zu finden. Die Methode ist einfach anzuwenden und kann mit minimaler Übung die gewünschten Ergebnisse liefern. Dieses Video wird helfen, die kleinen Details des Protokolls zu sehen.
Bevor Sie mit der Präparation beginnen, halten Sie alle Instrumente und Geräte auf Eis bereit. Nachdem Sie die euthanasierte Maus fixiert haben, besprühen Sie ihren Bauch mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit Schere und Pinzette einen V-förmigen Schnitt von 2,5 Zentimetern im Genitalbereich des Tieres und gehen Sie nach oben, um die Bauchhöhle vollständig zu öffnen.
Lokalisieren Sie den Magen auf der linken Seite der Maus und die Bauchspeicheldrüse, die sich in der Nähe der Milz befindet. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse mit zwei Pinzetten vom Magen und dem Zwölffingerdarm, ohne zu reißen. Fahren Sie fort und trennen Sie die Bauchspeicheldrüse vom Dünndarm, dem Jejunum und dem Ileum.
Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse auf die rechte Seite und trennen Sie die restlichen Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle mit einer Pinzette, um die Bauchspeicheldrüse und die daran befestigte Milz vollständig zu lösen. Entfernen Sie vorsichtig die Bauchspeicheldrüse ohne Mesenterialfett oder anderes angrenzendes Gewebe und breiten Sie sie zur Untersuchung in einer Petrischale auf Eis aus. Befolgen Sie die im Text erwähnte Zusammensetzung und bereiten Sie die Dissoziationspuffer 1 und 2, den Waschpuffer und die Enzymaktivitätsstopplösung im Voraus vor.
Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis und spülen Sie es mit 10%igem fötalem Rinderserum (FBS) und Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ab. Das Fett schwimmt und die Bauchspeicheldrüse sinkt ab. Dies ist eine einfache Möglichkeit, das kontaminierende weiße Fettgewebe, das noch an der Bauchspeicheldrüse haftet, sichtbar zu machen und schnell zu entfernen.
Als nächstes wird das Bauchspeicheldrüsengewebe der Maus in eine sterile Petrischale mit fünf Millilitern HBSS übertragen und bis zum Schneiden auf Eis gelegt. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Noyes-Schere und einem Skalpell in kleine Stücke von ein bis drei Kubikmillimetern. Nachdem Sie das Gewebe in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt haben, zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 350 g und vier Grad Celsius.
Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn, um Zellfragmente und Blutzellen zu entfernen. Resuspendieren, die Stücke in Dissoziationspuffer 1 mit 0,02 % Trypsin-C und 0,05 % EDTA für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Rühren suspendieren. Sofort mit 10 % FBS und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) waschen und fünf Minuten lang bei 350 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.
Waschen Sie erneut, indem Sie das Pellet in 10 Milliliter Waschpuffer resuspendieren und vor dem nächsten Dissoziationsschritt wie zuvor fünf Minuten lang zentrifugieren. Die Bauchspeicheldrüse wird im Dissoziationspuffer 2 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 180 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach 15 Minuten führen Sie eine mechanische Dissoziation durch, indem Sie die Pankreasfragmente mit sterilen serologischen Pipetten 10 Mal kräftig auf und ab pipettieren.
Wiederholen Sie den Vorgang mit Pipetten abnehmender Größe, beginnend mit 25, 10 bis 5 Millilitern. Inkubieren Sie die Probe, um sie auf 37 Grad Celsius zu bringen. Verwenden Sie Lichtmikroskopie, um die Dissoziation entsprechend der Menge der einzelnen Zellen in der Suspension zu überwachen.
Überwachen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau. Setzen Sie die Inkubation fort und überprüfen Sie die Dissoziation, indem Sie alle fünf Minuten Proben entnehmen. Inkubieren, bis 90% der Zellen in einzelne Zellen getrennt sind.
Nachdem das Pankreasgewebe gut dissoziiert ist, was durch das Verschwinden von Pankreasfragmenten und die zunehmende Trübung der Lösung angezeigt wird, stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie die Lösung zweimal mit Enzymaktivität fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius waschen. Halten Sie die Zellsuspension ab diesem Schritt auf Eis. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Nylonnetz.
Eine kleinere Nylon-Maschenweite kann die Lebensfähigkeit der Zellen verringern. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter dem Mikroskop. Resuspendieren und waschen Sie das Pellet mit 5 bis 10 Millilitern eiskalter gepufferter Waschlösung, bevor Sie die Zellen zählen.
Wenn mehrere rote Blutkörperchen beobachtet werden, behandeln Sie die Zellen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Erythrozyten-Lysepuffer. In Fällen, in denen Klumpen beobachtet werden, sollten die Proben erneut mit Trypsin behandelt werden, wie zuvor beschrieben. Wenn die Lebensfähigkeit weniger als 80 % beträgt, sollten lebende Zellen mit der magnetisch aktivierten Zellsortierung oder dem MACS-Kit zur Entfernung toter Zellen mit MACS-MS-Säulen isoliert werden.
Die rote Färbung des isolierten Pankreasgewebes resultierte aus der Expression von tdTomato in den Azinuszellen. In einem frühen Stadium der Dissoziation gab es eine geringe Anzahl isolierter Zellen und eine große Anzahl von Klumpen. Später wurden isolierte lebensfähige Zellen gewonnen, wobei die Anzahl der lebensfähigen Zellen nicht reduziert wurde.
Eine längere Inkubation verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen. Die tdTomato-positiven Zellen wurden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung geschätzt. Das Gentle Dissociation Protocol unterstützte die Rückgewinnung mehrerer Zelltypen mit hoher Lebensfähigkeit, die es ermöglichte, die Zellsortierung der gewünschten Zelltypen zu verfolgen.
Die Zählung von lebenden Zellen zu toten Zellen wurde mit einem Hämazytometer durchgeführt. Die Fluoreszenzbilder von gefrorenen Pankreasschnitten zeigten die tdTomato-positiven Azinuszellen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung bestätigte den Nachweis aller Zelltypen, die bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung in jedem resezierten Gewebe zu allen Zeitpunkten nachgewiesen wurden.
Die Carboxypeptidase1- oder CPA1-Expression in Azinuszellen wurde untersucht, was auf eine minimale Kontamination mit dem Transkriptom anderer Zelltypen hindeutet. Es ist wichtig zu beachten, dass längere Inkubationszeiten die Lebensfähigkeit der Zellen verringerten, daher ist es wichtig, die Probe zu überwachen und die Dissoziation des Gewebes und die Zelllebensfähigkeit alle paar Minuten unter dem Mikroskop zu beobachten. Das Zellisolierungsprotokoll kann für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die Kultivierung von Zellen oder als Ausgangsmaterial für Organoide verwendet werden.
Diese Technik ermöglicht es, die Entstehung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erforschen und die Wechselwirkungen zwischen Zellen zu untersuchen, die entzündetes oder krebsartiges Gewebe infiltrieren.
