Dieses Protokoll erzeugt Hochdurchsatz-Transkriptionsdaten einzelner menschlicher Isletzellen, die verwendet werden können, um die Heterogenität von Anochrome-Zellen zu untersuchen, den seltenen Zelltyp zu identifizieren und die Genregulation bei Krankheiten zu regulieren. Diese Technik erzeugt einzelzellgroße Daten größeren Maßstab, ist einfach zu bedienen und hat eine relativ kurze Verarbeitungszeit. Diese Methode kann auf Inselchen anderer Arten angewendet werden und andere frisch isolierte Gewebe profilieren.
Das Protokoll muss jedoch optimiert werden, um gewebespezifische Dissoziationsverfahren anzupassen. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige dissoziierte Zellen vorzubereiten. QC der Zellsuspension vor der einzelzelligen Partitionierung ist der Schlüssel, ebenso wie der sorgfältige und schnelle Umgang mit der Emulsion.
Einige Qualitäts-Checkpoints wie zu wissen, ob ein Chip verstopft ist, sind besser zu sehen als zu lesen. Nach dem Erhalt menschlicher Inselchen und dem Inkubieren über Nacht 200 bis 300 Inselchen mit einer P200-Pipette zählen und handverachten. Übertragen Sie die Inselchen in ein 15-Millimeter-Konusrohr mit fünf Millimetern kompletter Inselmedien, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius.
Legen Sie das Rohr zwei Minuten lang in eine Zentrifuge bei 200 mal G. Den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet auf dem Boden zu stören. Fügen Sie einen Millimeter vorgewärmte Zelldissoziationslösung hinzu und stören Sie das Pellet, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen.
Die Inselchen bei 37 Grad Celsius für neun bis elf Minuten bebrüten. Alle drei Minuten Pipette langsam für 10 Sekunden auf und ab, um die Zellen in einzelne Zellen zu trennen. Sobald die Isletzellen gut dissoziiert sind und die Lösung trüb wird, fügen Sie neun Milliliter komplette Islet-Medien hinzu und filtern Sie durch ein 30-Mikrometer-Zellsieb in eine neue 15-Milliliter-Konustube.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 mal G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 200 bis 300 Mikroliter 1X PBS 04%BSA Lösung wieder auf. Mischen Sie nun 10 Mikroliter der Zellkultur mit 0,5 Mikroliter AO/DAPI.
Pipette nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Laden Sie 10,5 Mikroliter auf einen Dia und führen Sie den Zellzähler auf einem fluoreszenzbasierten automatisierten Zellzähler aus, um Die Anzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Legen Sie einen mikrofluidischen Chip in ein Chipgehäuse.
Richten Sie das Chipgehäuse aus und stellen Sie sicher, dass Ölquellen der Person, die das Experiment durchführt, am nächsten sind. Verwenden Sie eine Pipette, um das berechnete Volumen der Zellen in die vorbereiteten Rohrstreifen einzuzahlen. Pipette fünfmal mischen.
Ohne die Pipettenspitzen zu entsorgen, übertragen Sie 90 Mikroliter Zellmischung in einen der Chips. Warten Sie 30 Sekunden, dann Pipette sehr langsam zu laden 40 Mikroliter GelPerlen, um zwei zu reihen. 270 Mikroliter Trennöl in die Brunnen der dritten Reihe geben.
Haken Sie die Chipdichtung an die Laschen des Chiphalters. Legen Sie den montierten Chiphalter in das Einzelzellen-Trenngerät und drücken Sie die Run-Taste. Nach Abschluss des Laufs die Spandichtung aus dem Halter nehmen, das Spangehäuse in einem 45-Grad-Winkel öffnen und 100 Mikroliter der Emulsion vom Chip in einen Brunnen in einer blauen Kunststoff-65-Wellplatte übertragen.
125 Mikroliter rosa Emulsionbrechenreagenz in jede Emulsion geben. Warten Sie eine Minute, und übertragen Sie dann das gesamte Volumen jedes Bohrguts in jede 0,2-Milliliter-Röhre. Stellen Sie sicher, dass sich eine klare Und eine Schicht von Rosa im Rohrstreifen befindet.
Mit einer Pipette 125 Mikroliter der rosa Schicht von der Unterseite des Rohrstreifens entfernen, ohne die klare Schicht zu stören. Es ist normal, dass ein kleines Volumen von ca. 15 Mikrolitern der rosa Schicht in der Röhre verbleibt. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Clean-up-Mix zu jedem der Rohrstreifen und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Übertragen Sie die Rohrstreifen auf einen magnetischen Ständer und warten Sie zwei Minuten, damit die Lösung abklarheit ist. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Dann die Perlen zweimal mit 80% Ethanol waschen.
Lassen Sie die Perlen für eine Minute trocknen. Entfernen Sie die Rohrstreifen vom Magneten und fügen Sie 35,5 Mikroliter Elutionslösung in die Perlen ein. Pipette, um die Perlen in der Lösung wieder aufzuhängen und für zwei Minuten bei Raumtemperatur zu brüten.
Übertragen Sie die Rohrstreifen auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die Lösung ablöschen. Übertragen Sie die gereinigte Komplementär-DNA aus den Rohrstreifen, um 0,2-Milliliter-Rohrstreifen zu reinigen. Um die komplementäre DNA zu verstärken, fügen Sie zunächst 65 Mikroliter komplementärer DNA-Amplifikations-Master-Mix zu jeder Probe hinzu.
Legen Sie die Rohrstreifen in einen Thermocycler und führen Sie das Programm entsprechend dem Manuskript aus. Die Proben können bei vier Grad Celsius bis zu 72 Stunden gelagert werden. Nach normalisierender DNA auf 15 Anagramme und 20 Mikroliter mischen sich aliquot 30 Mikroliter Tagmentation zu jeder ergänzenden DNA-Probe auf Eis.
Legen Sie die Proben in den Thermocycler und führen Sie das Tagmentationsprotokoll bei 55 Grad Celsius für fünf Minuten, abnehmend auf 10 Grad Celsius und halten. Fügen Sie dann 60 Mikroliter Probenindex PCR Master Mix und 10 Mikroliter 20-Mikromolar-Forolegol-Probenindex in die 30-Mikroliter-gereinigte komplementäre DNA-Probe ein. Geben Sie die Rohre an den Thermocycler zurück, um das endgültige Bibliotheksprodukt zu verstärken.
Normalisieren Sie jede Probe mit Wasser auf zwei Nanogramm pro Mikroliter und ziehen Sie drei Mikroliter jeder normalisierten Probe in einem 1,5-Milliliter-Rohr zusammen. Pool mit Elutionspuffer auf 0,25 Nanogramm pro Mikroliter verdünnen. Denaturieren Sie den Pool durch Die Kombination von 12 Mikrolitern der verdünnten Poolprobe, einem Mikroliter eines Tieres oder einer DNA-Kontrolle, zwei MikroliterElutionspuffer und fünf Mikroliter 0,4 normales Natriumhydroxid.
Inkubieren Sie die Mischung für fünf Minuten, dann fügen Sie 10 Mikroliter von 200-Millimolar Tris bei pH8, und laden 4,05 Mikroliter der Mischung in 1345.95 Mikroliter HTA-1. Als nächstes laden Sie 1,3 Milliliter in die Sequenzerpatrone und laufen sie gemäß den Richtlinien des Herstellers nach einem Sequenzierungsrezept. Führen Sie auf dem Computer Cell Ranger aus, um unformatierte Basisaufrufdateien zu demultiplexieren, die durch Sequenzierung in FASTQ-Dateien generiert werden.
Richten Sie FASTQ-Dateien an der menschlichen B37.3-Genomassembly aus und verwenden Sie das CSC-Genmodell, um die Expressionsquantifizierung zu erhalten. Untersuchen Sie das Barcode-Rangdiagramm, um sicher zu sein, dass die zellenassoziierten Barcodes und der Hintergrund getrennt werden. Um die Zellqualität zu kontrollieren, schließen Sie Zellen mit weniger als 500 nachgewiesenen Genen, weniger als 3.000 Gesamtzahl eindeutiger molekularer Identifikatoren und mehr als 0,2 Lebensfähigkeitswerte aus.
Passen Sie die Cut-offs nach Gewebe- und Zelltypen an. Als nächstes verwenden Sie R-Paket mclust, um Zellen zu entfernen, die mehr als ein Hormongen exprimieren. Verwenden Sie R-Paket Seurat, um die Genexpression mit den gesamten eindeutigen molekularen Identifikatoren zu normalisieren und mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 auf Zellebene zu multiplizieren.
Dann erkennen Sie variable Gene unter Verwendung der durchschnittlichen Expression und Dispersion aller Zellen. Passen Sie die Cut-offs an die Gewebe- und Zelltypen an. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse mit den variablen Genen durch.
Clusterzellen mit einer ausgewählten Anzahl von Hauptkomponenten. Ableiten von Zellcluster-angereicherten Genen durch Vergleich eines Zellclusters mit den übrigen Zellen. In diesem einzelzelligen RNA-Sequenzierungsprotokoll wurden die erworbenen menschlichen Inselchen zunächst dissoziiert, wie durch die Alpha- und Betazellen in der RNA-Fluoreszenz und C2-Hybridisierung validiert.
Ein erfolgreiches Beispiel für Emulsion nach dem Trennschritt zeigt eine einheitliche blasse, trübe Lösung mit minimalem Trennöl, das von den Gelperlen getrennt ist. Im Gegensatz dazu könnte eine minderwertige Emulsion mit klarer Phasentrennung zwischen Gelperlen und Öl auf eine Verstoclaute während des Spanlaufs zurückzuführen sein. Nach der komplementären DNA-Verstärkung zeigt eine repräsentative fragmentgroße Verteilung den typischen Höhepunkt für eine hochwertige komplementäre DNA-Probe, die sich in der Nähe von 1 000 bis 2 000 Basenpaaren befindet.
Die Spitze in der Nähe von 600 Basenpaaren war spezifisch für die letp-komplementäre DNA. Die fragmentgroße Verteilung für die RNA-Sequenzierungsbibliotheken lag zwischen 300 und 500 Basenpaaren. Die Clustering-Analyse ergab 12 Zelltypen im Raum der T-verteilten Stochastic Neighbor Embedding-Dimensionen.
Drei Subpopulationen in Alphazellen und vier in Betazellen wurden aufgedeckt. Diese Technik ermöglicht es Forschern, eine umfassende Zellinsel für menschliche Inselchen zu bauen. Mit mehr Daten von nicht-diabetischen und diabetischen Spendern, es wird für Ressourcen für die therapeutische Zielentdeckung verwendet.
