Wir möchte Kaisa Ikkala für ihre wertvolle technische Hilfe und aufschlussreiche Hilfe, wenn Sie diese Methode Aktualisierungstendenz sowie später bei der Umsetzung auf unsere zentralen Forschungsfragen zu danken. Wir möchten auch Laboratory Animal Center und Anna Meller für ihre Hilfe bei der Planung der Richtlinien der tierärztlichen Arbeit danken.

Alle Experimente werden von den nationalen Tierversuch Board genehmigt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie alle Lösungen und halten bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Befolgen der Abfallentsorgung zu entsorgen verwendete Materialien und Lösungen.</li>
	<li>Verwendung NMRI und ICR fremd-Bestände Alter zwischen 4 und 12 Wochen und beiderlei Geschlechts. Wenn den Stamm C57BL/6 verwenden, folgen Sie den Ketamin-Medetomidine Vorbereitung Methode im Schritt 1.3.2. Folgen Sie für weitere Schritte den Anweisungen in 1.3.3.-1.3.5 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Veterinärmedizin, frisch und in der Zeit vor der Inbetriebnahme. Carprofen wird später verwendet werden, so ist es nicht notwendig, um es an dieser Stelle vorbereitet.<ol>
<li>Um eine Lösung von Ketamin-Medetomidine Anästhesie vorzubereiten, mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin (Ketaminol Vet) mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine (Cepetor Vet) und 1,25 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg, Ketamin und 1 mg/kg, Medetomidine).</li>
		<li>Um eine mehr verdünnte Lösung von Ketamin-Medetomidine Vorbereitung der Anästhesie bei C57BL/6 Mäusen mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine und 2,5 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (3,75 mg/kg, Ketamin und 0,5 mg/kg, Medetomidine). Hinweis: Dies ist eine alternative Schritt nur für Erwachsenen C57BL/6 Mäusen.</li>
		<li>Zur Analgesie Buprenorfin Vorbereitung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 0,3 mg/mL) des Buprenorfin auf 1,9 mL steriler 0,9 % NaCl. 0,2 mL/20 g Maus Gewicht (0,15 mg/kg) zu verwalten.</li>
		<li>Atipamezol Vorbereitung für die Anästhesie Einstellung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 5 mg/mL) von Atipamezol bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Verwenden Sie für Analgesie während der Post-Narkose Carprofen. Fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Carprofen bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluoreszierende Färbelösung vorbereiten<ol>
<li>Zur Visualisierung des Abrieb unter dem Kobalt Blaulicht (Abbildung 1), verwenden Sie eine fluoreszierende Lösung. Bereiten Sie eine 0,1 % Fluorescein-Lösung durch die erste Messung 10 mg von Fluorescein Salz mit einer feinen Skala und fügen Sie ihn auf 10 mL in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Die Fluorescein-Lösung vor Licht schützen und für 5 Minuten auf einem Shaker schütteln. Hinweis: Die Fluorescein-Lösung ist lichtempfindlich; halten Sie die Lösung von Licht bedeckt. Diese Lösung kann für 2-3 Tage bei + 4 ° C aufbewahrt werden. Für den Einsatz ist es hilfreich, die Fluorescein-Lösung in einer Tropfflasche zu legen, die für Augentropfen verwendet wird. Verwenden Sie ein Sterilfilter, beim Wechsel der Lösung auf die Tropfflasche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie die okuläre Burr-Tipp vor und nach Gebrauch; zuerst mit PBS und dann mit 70 % EtOH. Wenn einen Abrieb an mehrere Mäuse während der gleichen Operation vorgenommen werden, tun die Reinigungsschritte zwischen jeder Maus.</li>
	<li>Die beheizte Platte auf (+ 37 ° C) und platzieren Sie ein Papiertuch auf ihn.</li>
</ol>(2) Korneaabnutzung
Achtung: Verwenden Sie Schutzkleidung (Handschuhe, Kittel) beim Umgang mit Mäusen. Wiegen Sie die Maus, um das Volumen der Medikamente zu verabreichen zu schätzen.
<ol><li>Verwenden Sie die einhändige scruffen Methode um die Maus23behandeln. Ketamin-Medetomidine Mischung intraperitoneal verwalten (i.p.) auf den linken Unterbauch. Platzieren Sie den Mauszeiger in einen einzelnen Käfig und warten Sie, bis es zum Einschlafen. Dies dauert in der Regel weniger als 5 Minuten. Verwalten Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen dann. Verwenden Sie die gleichen Umgang mit Technik. Hinweis: Wenn Anästhesie gegeben ist, sollte das Protokoll nicht jederzeit angehalten werden.</li>
	<li>Prüfen Sie bevor Sie fortfahren, ob die beheizte Platte warm ist. Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf der beheizten Platte. Das Niveau der Anästhesie ist gut, wenn der Schweif Reflex fehlt, aber der Fuß-Reflex vorhanden ist. Überprüfen Sie diese Reflexe durch Kneifen das Heck und alle Zehen mit den Fingern oder einer Pinzette. Keine Gewalt anwenden. Anästhesie ist 20-25 Minuten.</li>
	<li>Um einen Abrieb zu machen, verwenden Sie den gereinigten okulären Grat. Drehen Sie die Basis der Grat schalten Sie die Vibration, die unerlässlich ist, den Abrieb zu machen. Spüren Sie die Vibration in der hand, wenn der Grat einwandfrei funktioniert.<ol>
<li>Öffnen Sie ein Auge zu einer Zeit, indem Sie die Augenlider separat mit den Fingern halten. Dann fest berühren Sie den Grat an der Hornhaut und bewegen Sie das Gerät hin und her sowie auf der Augenoberfläche wie seitwärts. Die Grat Schwingung führt den Kratzer; nicht drücken, schütteln oder die Hornhaut zu reißen. In der zentralen Hornhaut sind 20 schleifende Bewegungen auf der Oberfläche ausreichen, um die Wunde zu induzieren. Heben Sie den Grat nicht und versuchen Sie, bleiben in der Region der Hornhaut abgeschliffen werden. Erwerb eines Standardgröße Abrieb werden mehrere Runden der Praxis erfordern.</li>
	</ol>
 Hinweis: Hornhaut Asepsis vor Abrieb lässt sich mithilfe von ophthalmologischen Betadine Lösung.</li>
</ol>(3) Bildgebung den Abrieb
<ol><li>Die abgeriebenen Region mit Kobaltblau Stift Licht (Abbildung 1) und Fluorescein Lösung zu beleuchten. Die Augenoberfläche wird farblos bei Umgebungslicht. Nach Fluorescein Anwendung fluoresziert abgeschürfte Region in grün, wenn das Auge mit dem Stift Licht beleuchtet.<ol>
<li>Bei Bedarf öffnen Sie das abgeschliffene Auge ähnlich wie bei 2.3 und verwalten Sie einen Tropfen von Fluorescein-Lösung aus der Tropfflasche. Waschen Sie das Auge einmal mit PBS oder 0,9 % NaCl, Hintergrund der Fluorescein zu reduzieren. Verwenden Sie eine Tropfflasche oder Pipette zum Waschen. Aspirieren Sie die Flüssigkeit mit einem weichen Tuch entfernt und reinigen Sie die Wimpern nach Bedarf. Die überschüssige Flüssigkeit sammelt sich in der Regel zur nasalen Grenze des Auges, in der Nähe von der Eröffnung des Kanals Träne. Achtung: Berühren Sie die Hornhaut während Ablaufrinnen da kleinere Abschürfungen induziert werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Machen Sie Fotos von der korneaabnutzung.<ol>
<li>Um ähnliche Bilder bei allen bildgebenden Sitzungen zu erhalten, verwenden Sie stabile Befestigung Werkzeuge für das Kobaltblau Stift Licht und die SLR-Kamera (Abbildung 2). Dieses Protokoll bietet eine Setup, das einfach zu wiederholen (Abbildung 2).<ol>
<li>Um das Stift Licht und die Kamera zu befestigen, verwenden Sie eine Tischleuchte mit flexiblem Arm und Klemme und einen verstellbaren Kameraarm mit einer Klammer bzw.. Kabelbinder der Stift leicht um die Tischleuchte und Position genau über die Maus Auge. Positionieren das Licht anders könnte die Visualisierung der Abrieb verändern. Ein Vorschlag für die Positionierung dieser Werkzeuge ist in Abbildung 2beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie die SLR-Kamera um zu fotografieren des Auges. Legen Sie das Tier in einen gewünschten Abstand, Position und Ausrichtung der Kamera (01:12) im Raumlicht. Danach schließen Sie alle anderen Lichter außer Kobaltblau Stift Licht. Hinweis: Den Stift leicht Griff nach unten mit Klebeband oder verwenden Sie ein Gummiband um das Licht auf die ganze Zeit während der Bildgebung zu halten. Dies könnte helfen, wenn das Bild unscharf wird. Es ist am einfachsten, die bildgebende Schritt mit einem Kollegen durchführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) aufwachen nach Korneaabnutzung
<ol><li>Verabreichen Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen. Verwenden Sie die gleiche Handhabung Technik wie in 2.1.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der antibakteriellen, Fucidin Säure Augensalbe (Isathal) abgeschliffen und nicht abgeschliffen Augen zu befeuchten der Augenoberfläche sauber von Bakterien nach der Narkose.</li>
	<li>Wie die Maus in 5-20 Minuten auf der beheizten Platte aufwachen wird, beobachten Sie die Maus während der Post-Narkose aufwachen-Periode. Wenn es mobiler wird, legen Sie sie in einen einzelnen Käfig. Hinweis: Wenn Aufwachen länger dauert, platzieren Sie den Mauszeiger in den Käfig mit einem beheizten Pad oder legen Sie den gesamten Käfig auf der beheizten Platte und überwachen Sie die Maus regelmäßig zu. Während die Narkose nachlässt, wird die Maus in der Regel schüttelt und nach oben mit dem vorderen Körper erreicht. Dieses Verhalten sollte wieder normal in ca. 3-4 Stunden und dann platzieren Sie die Maus wieder zu einem gemeinsamen Käfig.</li>
	<li>Carprofen i.p für Analgesie und Auge Salbe an zwei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Abrieb, ähnlich wie in den Schritten 2.2 zu verwalten. und 4.2.</li>
</ol>(5) Bildgebung bei der Wundheilung
<ol><li>In diesem Protokoll weist Nutzungszeit 18 h und 72 h nach Abrieb, der Wundverschluss zu beobachten.<ol>
<li>Betäuben Sie für aufeinander folgende Aufnahmen die Mäuse wie unter 2.2 erläutert.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder, wie in 3 erläutert.</li>
		<li>Die Tiere mit Atipamezol i.p wachen Sie auf und überwachen Sie den Wake-up Zeitraum zu, wie in 4.3 erläutert. Hinweis: Wenn nicht weiter das Follow-up, einschläfern der Maus direkt nach 5.1.2. Sterbehilfe ist in 6.1 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Hornhaut Sammlung und Paraffin einbetten
<ol><li>Hinter dem letzten Zeitpunkt das Tier zu opfern. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine Kammer, die mit CO2gefüllt werden kann. Füllen Sie die Kammer Luft mit CO2. Wenn das Tier unbeweglich ist, verrücken der Halswirbel durch Ziehen fest von der Schwanzwurzel und Halsbereiches gleichzeitig nach unten drücken. Achtung: Befolgen Sie die Richtlinien des lokalen Tierschutz Körpers.</li>
	<li>Sammeln Sie die ganze Augapfel durch eine Öffnung in der Haut an der Seite des Auges mit Dissektion Schere schneiden. Legen Sie die Schere unter den Augapfel und Schneiden des okulären Nervs um den Augapfel aus der Umlaufbahn pop. Verwenden Sie Pinzette, wenn das Auge nicht leicht herauskommen.<ol>
<li>Machen Sie ein Loch auf der Rückseite des Auges auf der Netzhaut Seite mit einer 26G-Nadel zu Lösungen im Inneren des Auges frei eindringen. Hinweis: Lassen Sie nicht das Auge trocken, stattdessen werden, legen Sie es in PBS bis fort mit dem Protokoll.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie den Augapfel in der 2-mL-Tube mit PBS. Unterbrochen Sie das Experiment nicht an dieser Stelle.</li>
	<li>PBS zu entfernen und Augäpfel in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei + 4 ° C für 4-5 Stunden zu beheben.</li>
	<li>Bewegen Sie den festen Augapfel zu einer Gewebe-Kassette für Gewebe Verarbeitung. Benutzen Sie ein Tuch Verarbeitung Maschine und das folgende Programm:<ol>
<li>Spülen mit PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie 2 x 45 min in 70 % igem Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 2 x 1 h in 94 % Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 45 min. in absoluten Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 1 h in Xylol, bei Raumtemperatur und letzten Xylol bei 37 ° c</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 1 h in Paraffinwachs bei 60 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betten Sie nach Gewebe Verarbeitung den Augapfel in flüssiges Paraffin (+ 60 ° C) mit einem Gewebe einbetten Block ein. Legen Sie das Auge innerhalb des Blocks, so dass es zur Seite schaut und die peripheren Grenze nach oben zeigt. Lassen Sie den Block auf einem kühlen Teller für ca. 5-10 Minuten zu festigen.</li>
</ol>(7) Paraffin Abschnitte der Hornhaut
<ol><li>Bereiten Sie das Mikrotom für Schnitt gemäß den Anweisungen des Instituts oder des Herstellers. Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit scharfen Mikrotom Klinge.</li>
	<li>Ort ein Wasserbad mit Raumtemperatur Reinstwasser neben Mikrotom und ein weiteres mit Reinstwasser beheizt bis + 50 ° C.</li>
	<li>Machen Sie 5 µm dicke Schichten des Augapfels. Hinweis: Die Linse leicht bricht beim Schneiden. Um dies zu vermeiden, wischen Sie die Schnittfläche mit einem feuchten Tuch jedes Mal eine neue Reihe von Abschnitten gestartet wird. Verwenden Sie Leitungswasser, das Gewebe zu befeuchten.</li>
	<li>Legen Sie die Abschnitte nebeneinander im Wasserbad Raumtemperatur und verschieben Sie sie dann in dem heißen Wasserbad mit Hilfe von einem Objektträger. Dehnen Sie die Abschnitte in dem heißen Wasserbad, bis alle Falten entspannen und die Abschnitte werden Matte.</li>
	<li>Trocknen Sie die Glas-Objektträger mit Abschnitten über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Folien zuordnen Sie in den Abschnitten, indem man die Folie für 1 Minute auf einer beheizten Platte bei + 60 ° C. Danach können bei + 4 ° C. die Abschnitte direkt zum Beizen, immunohistologische Methoden verarbeitet oder gespeichert werden</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Verwundung Methoden sind populäre Werkzeuge, verschiedene Aspekte der Hornhaut Homöostase und Pathologien zu studieren. Der Abrieb-Modell bietet eine gut kontrollierte Methode zur relevanten Probleme in der Augenheilkunde. Allerdings sind einige kritische Punkte im Protokoll hervorzuheben. Insbesondere die Details bezüglich der Veterinärmedizin, heilende Wunde Timeline und Ergebnis skizziert sind optimiert für den Einsatz mit fremd-NMRI und ICR-Aktien, aber können unter Stämme von Mäusen26...

Epitheliale Schichten zahlreiche Organe sind Verletzungen ausgesetzt. Sie enthalten jedoch auch die Möglichkeit zum Ausgleich Gewebeverlust durch Wundheilung. Die Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Es bildet die äußere Oberfläche des Auges und bietet eine Schutzschicht für die sensible okuläre Maschinen. So funktioniert Hornhaut als eine physikalische Barriere gegenüber Krankheitserregern und Wasserverlust. Es besteht aus drei Schichten; Epithel, Stroma und Endothel. Das Epithel der Hornhaut bildet die äußerste Schicht der Hornhaut. Epithelzellen pflegen die Barrierefunktion der Hornhaut durch die Einhaltung streng miteinander durch tight Junctions1,2,3. Eine azelluläre Hornhaut Basalmembran, die Bowman-Membran trennt das Epithel aus der umfangreichen Stroma, das feuerfeste keratozyten enthält. Unter das Stroma Kanal endotheliale Zellen Nährstoffe, Wasser und Sauerstoff, die obere Schicht.
Hornhauterosionen sind sehr häufig in der Klinik4. Verletzungen der Hornhaut sind vielfältig, aber vor allem durch kleine Partikel wie Staub oder Sand, Kratzer oder andere Fremdkörper verursacht werden. Das Protokoll beschrieben hier zielt auf eine klinisch relevante Art von epithelialen korneaabnutzung zu reproduzieren. Dabei bietet dieses Protokoll eine kontrollierbare und bahnbrechende Methode für Kliniker und Wissenschaftler Hornhaut, in eigenen Studien zu implementieren. Wir haben eine in Vivo Verletzung Reparatur Assays auf der murinen Hornhaut durch Anrauen des Gewebes mit einer getrübten okuläre Burr, Algerbrush II durchgeführt. Unser Ziel hier, den Abrieb nur auf der zentralen Hornhaut-Epithel und lassen Sie die anderen Teile der Orgel ohne Schaden. So, das Protokoll ist ideal, um Studie Hornhaut Epithelzelle Dynamik oder der Basalmembran während Re Epithelisierung, Migration, Proliferation und Differenzierung in Vivo5Zelle. Vor kurzem wurde dieses Modell zum Analysieren der Stammvater Zelldynamik in der murinen Hornhaut als auch hinsichtlich der Kapazität der differenzierten Hornhaut epithelialen Zellen bei der Neugründung der Hornhaut Stammzellnische nach Verletzungen6,7zu enthüllen. Nach Abrieb kehrt die Hornhaut zu seiner normalen Transparenz und Zugfestigkeit. Interessant ist, eine in-vitro- Studie angedeutet, dass re Epithelisierung ohne erhöhte Zelle Verbreitung8tritt. Dieses Protokoll beschreibt die Zeitachse der ununterbrochenen Heilung in der murinen Hornhaut. Die Methode ist somit anwendbar, die Wirkung von Medikamenten auf die Heilung von Mustern und Geschwindigkeit zu testen.
Die Hornhaut ist beträchtlich für Wundheilung Studien benutzt worden. Jedoch haben viele Studien auf andere Modelle der Verletzung verlassen. Ein gut etabliertes Modell der Verletzung der Hornhaut ist die alkalische brennen, die durchgeführt wird, durch die Anwendung von Natriumhydroxid (NaOH) mit oder ohne Filterpapier auf die Hornhaut-Oberfläche-9. Alkalische Exposition führt zu einer großen und diffuse Verletzung, die betrifft nicht nur das Hornhaut-Epithel, sondern auch die Bindehaut und Stroma9,10. Starke alkalische Lösungen nachweislich hornhautgeschwüren, eintrübt und Neovaskularisation9induzieren. Entzündungszellen dringen in das Stroma in der Regel innerhalb von 6 h und bleiben dort bis zum 24 h-11. Somit ist alkalisch Verletzungen eine ratsam Methode in Studien im Zusammenhang mit Stromazellen Aktivierung. Eine andere Art von chemischen Verletzungen kann durch die Anwendung von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zugefügt werden, auf die Hornhaut9,10. Andere häufig verwendete Verletzungen Modelle umfassen incisional Wunden, die durch die Stroma und Keratektomie Wunden eindringen, die auf den oberen Teil der Stroma14,15beschränkt sind. Diese Methoden eignen sich auch zur Rede und Antwort bezüglich Stromazellen Wundheilung. Verschiedene Verletzungen Modelle haben ihre eigenen vor- und Nachteile. Abrieb oder Debridement, der das Hornhaut-Epithel wurde zuerst mit getrübten Skalpelle oder klingen auf ex Vivo Hornhaut16entwickelt. Diese Methode wurde später verwendet in Vivo auf Maus, Ratte und Kaninchen17,18,19,20,21,22. Mit Hilfe des okulären Grates (Abbildung 1), entfernen wir nur einen ausgewählten Bereich des Epithels, ohne Auswirkung auf den Rest des Epithels. Auf diese Weise ist es möglich auf die epithelialen Entfernung zu den verschiedenen Teilen der Hornhaut. Darüber hinaus kann die Größe der Abrieb mit Fluorescein Beflecken beurteilt werden. Darüber hinaus folgen wir hier Abrieb Schließung während der Einheilphase.
Diese Methode birgt einige Vorteile, i) einschließlich der genauen Standort der Abrieb Website, die nicht mit chemischen Verletzungen möglich ist, (Ii) der Abrieb ist schnell durchzuführen, und (Iii) Es ist nicht-invasiv. Hier beschreiben wir die Methode mit der outbred NMRI Maus als Modell, aber dies angewendet werden könnte, die breite Palette von genetischer Mausmodelle sowie der Ratte und Kaninchen, die gängigen Modelle zur Untersuchung der menschlichen Hornhaut Störungen sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

Die murine Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Die Hornhaut ist die äußerste Schicht des Auges, und somit ist die erste Verteidigungslinie zu Verletzungen. In der Tat ist die häufigste Art von Verletzungen am Auge gefunden in Klinik ein korneaabnutzung. Hier nutzen wir eine augenfällige Grat um einen Abrieb was Entfernung des Hornhaut-Epithel in Vivo an narkotisierten Mäusen zu induzieren. Diese Methode ermöglicht gezielte und reproduzierbare epithelialen Störung, wobei andere Bereiche intakt bleiben. Darüber hinaus wir beschreiben die Visualisierung der abgeriebenen Epithel mit Fluorescein beflecken und liefern konkrete Ratschläge wie man die abgeriebenen Hornhaut zu visualisieren. Dann folgen wir die Zeitleiste der Wundheilung 0, 18 und 72 h nach Abrieb, bis die Wunde wieder epithelialized ist. Die epithelialen Abrieb Modell der Verletzung der Hornhaut ist ideal für Studien zur epithelialen Zell-Proliferation, Migration und Re Epithelisierung der Hornhaut Schichten. Diese Methode ist jedoch nicht optimal Stromazellen Aktivierung bei der Wundheilung, zu studieren, weil der okuläre Grat nicht um die Stromale Zellschichten eindringt. Diese Methode ist auch geeignet für klinische Anwendungen, z. B. der präklinischen Prüfung der Wirksamkeit der Droge.

Dieses Protokoll beschreibt ein Modell, um eine Verletzung der Maus Hornhaut Abrieb zufügen und Lösungsvorschläge zu folgen und den Heilungsprozess nach Abrieb zu visualisieren. Vor kurzem haben wir diese Methode zur Untersuchung der Rolle von Hornhaut epithelialen Progenitorzellen bei Wundheilung6beschäftigt. Der Einsatz von etablierten Werkzeugen ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Abrieb-Experiment. Wir und andere haben den Algerbrush II okulären Grat...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Aufrufe.  University of Helsinki. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

Serie: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Multimodale Quantitative Phase Imaging mit digitalen holografischen Mikroskopie Beurteilt Exakt Darmentzündung und Epithelial Wundheilung

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Entwicklung eines Direkt Pulp-Kappungsmodell für die Beurteilung von Pulpal Wundheilung und Reparative Dentinbildung bei Mäusen

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

Ausrichtung auf graue Rami Communicantes im selektiven chemischen lumbale Sympathektomie

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...