우리는 Kaisa Ikkala 나중에 우리의 중앙 연구 질문에 구현 하는 동안 뿐만 아니라 그녀의 귀중 한 기술 지원 및 통찰력이 도움이 때이 방법을 현실화에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 실험실 동물 센터와 안 나 Meller 수의학 작업의 지침을 계획 그녀의 도움에 감사 하 고 싶습니다.

모든 실험 국가 동물 실험 보드에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
<ol><li>모든 솔루션을 준비 하 고 실내 온도에서 달리 명시 하지 않는 한 계속. Dispose 사용 재료 및 솔루션 폐기물 처리 규정을 따릅니다.</li>
	<li>사용 NMRI와 ICR outbred 주식, 4-12 주 세 중 성별 사이의. C57BL/6 긴장을 사용 하 여 단계 1.3.2에서에서 케 타 민-medetomidine 준비 방법을 따르십시오. 다른 단계에 대 한 1.3.3.-1.3.5에 설명 된 지침을 따릅니다.</li>
	<li>신선 하 고 작업을 시작 하기 전에 시간에 수의학을 준비 합니다. Carprofen 나중에 사용 될 것입니다, 그리고 따라서 그것은 시점에서 그것을 준비 하는 데 필요한.<ol>
<li>혼합 0.375 mL 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 솔루션을 준비, (재고 농도 50 mg/mL) 0.25 mL와 케 타 민 (Ketaminol 수 의사)의 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine (Cepetor 수 의사)의 살 균 0.9%의 1.25 mL을 추가 하 고 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg, 케 타 민 1 mg/kg, medetomidine)의 관리.</li>
		<li>0.375 mL를 혼합 C57BL/6 마우스에 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 더 묽 게 한 해결책을 준비, (농도 재고 50 mg/mL)의 0.25 mL와 케 타 민 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine의 살 균 0.9%의 2.5 mL을 추가 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (3.75 mg/kg, 마 취 제 및 0.5 mg/kg, medetomidine)의 관리. 참고: 이것은 성인 C57BL/6 쥐에 대해서만 대체 단계입니다.</li>
		<li>진통에 대 한 buprenorfin을 준비 하려면 추가 0.1 mL (재고 농도 0.3 mg/mL) 살 균 0.9%의 1.9 ml buprenorfin의 NaCl. 0.2 mL/20 g 마우스 무게 (0.15 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
		<li>마 취를 중단에 대 한 atipamezole를 준비 하려면 0.1 mL을 추가 (농도 재고 5 mg/mL) atipamezole 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (0.75 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
		<li>후 마 취 동안 진통 carprofen을 사용 합니다. 0.1 mL를 추가 (재고 농도 50 mg/mL) carprofen 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg)의 관리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 성 얼룩 솔루션 준비<ol>
<li>코발트 블루 빛 (그림 1) 아래 마모를 시각화에 대 한 형광 솔루션을 사용 합니다. 벌금 규모와 fluorescein 소금의 첫 번째 측정 10 밀리 그램으로 0.1 %fluorescein 솔루션을 준비 하 고 인산 염 버퍼 염 (PBS) 10 mL를 추가.</li>
		<li>빛에서 fluorescein 솔루션을 보호 하 고 통에 5 분 동안 흔들어. 참고: fluorescein 솔루션은 빛에 민감한; 빛에서 포함 하는 솔루션을 유지. 이 솔루션은 2-3 일 동안 + 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 사용을 위해 안 약에 사용 되는 스 포 이트 병 fluorescein 솔루션 에서도 도움이 됩니다. 살 균 필터를 사용 하 여 솔루션 스포이드 병에 이동할 때.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용; 전후 눈 버 팁 청소 먼저 PBS 그리고 70 %EtOH. 동일한 작업 중 여러 마우스 한 마모를 만드는 경우 각 마우스 사이 청소 단계를 수행.</li>
	<li>(+37 ° C)에 온수 접시를 놓고 그것에 종이 타월 장소.</li>
</ol>2. 각 막 마포
주의: 사용 보호 의류 (장갑, 랩 코트) 때 쥐를 처리. 체중 관리 하는 약물의 양을 견적 하는 마우스.
<ol><li>한 손으로 scruffing 메서드를 사용 하 여 마우스23처리 하. 케 타 민-medetomidine 혼합물을 intraperitoneally 관리 (i.p.) 왼쪽 낮은 복 부. 마우스를 개별 케이지를 놓고 잠들 때까지 기다립니다. 이 일반적으로 5 분 미만 걸립니다. 그런 다음, 첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 동일한 처리 기술을 사용 합니다. 참고: 일단 마 취를 부여 프로토콜 해야 하지 일시 정지 됩니다 언제 든 지.</li>
	<li>계속 하기 전에 온수 접시 따뜻한 인지 확인 합니다. 온수에 마 취 마우스를 놓습니다. 마 취의 레벨은 꼬리 반사 이다 결 석, 하지만 발가락 반사는 존재 하는 경우에 좋다. 꼬리와 손가락 또는 집게와 모든 발가락을 곤란 하 게 하 여 이러한 반사를 확인 합니다. 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오. 마 취는 지난 20-25 분을 것입니다.</li>
	<li>한 마모 청소 눈 버를 사용 합니다. 회전 하는 마모를 확인 하는 것이 필수적입니다 진동 설정에 버의 베이스. 버 제대로 작동 하는 때, 손에 진동 느낌.<ol>
<li>별도로 손가락으로 눈 꺼 풀을 눌러 한 번에 한쪽 눈을 엽니다. 단단히 각 막에 버 터치 그리고 눈 표면에 악기 뿐만 아니라 뒤로 및 앞으로 옆으로 이동 합니다. 버 진동 수행 처음; 누르면, 동요 하거나 마십시오 눈물 각 막. 중앙 각 막에서 표면에 움직임 abrading 20는 상처를 유발 하기에 충분. 에 버를 들어올린 침식 될 각 막의 영역에 체류 하려고 하지 마십시오. 표준 크기의 마모를 취득 실천의 여러 라운드를 요구할 것 이다.</li>
	</ol>
 참고: 각 막 무 균 상태 얻을 수 있습니다 전에 마모 betadine 안과 솔루션을 사용 하 여.</li>
</ol>3. 이미지는 마모
<ol><li>코발트 블루 펜 빛 (그림 1)과 fluorescein 솔루션을 사용 하 여 침식된 영역을 밝게. 안구 표면 주변광에 무색 나타납니다. Fluorescein 신청 후 침식된 지역 fluoresces 녹색에서 빛 펜으로 눈을 조명 하는 때.<ol>
<li>필요한 경우, 2.3에서 마찬가지로 침식된 눈 열고 fluorescein 솔루션의 한 방울 스포이드 병에서 관리 합니다. PBS와 0.9%에 한 번 눈을 씻고 NaCl을 줄이기 위해는 fluorescein의 배경. 점 적기 병 또는 한 피 펫을 사용 하 여 세탁. 소프트 삭제 기능으로 멀리 액체를 발음 하 고 필요한 경우는 속눈썹을 청소. 과잉 액체는 일반적으로 눈물 운하의 개통에 가까운 눈, 비 강 국경에 수집합니다. 주의: 약간의 찰과상이 유도 될 수 있습니다으로 cleaining 동안 각 막을 만지지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 막 찰과상의 사진을 찍을.<ol>
<li>각 이미지 세션 동안 비슷한 이미지를 얻으려면 코발트 블루 펜 빛과 SLR 카메라 (그림 2)에 대 한 꾸준한 첨부 파일 도구를 사용 합니다. 이 프로토콜은 (그림 2)를 반복 하기 쉬운 설치를 제공 합니다.<ol>
<li>펜 라이트와 카메라 연결할 테이블 램프 유연한 팔과 클램프 및 조정 가능한 카메라 팔은 클램프와 함께 각각 사용 합니다. 케이블 넥타이 펜 마우스 눈 바로 위에 위치 하 고 테이블 램프에 빛. 빛을 다르게 위치는 마포의 시각화를 변경 될 수 있습니다. 이러한 도구를 위치에 대 한 제안 그림 2에 설명 되어 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SLR 카메라를 사용 하 여 눈의 사진을 찍을. 방 조명에 원하는 거리와 위치와 초점 카메라 (1:12)에 동물을 놓습니다. 그 후, 코발트 블루 펜 라이트를 제외 하 고 다른 모든 빛을 닫습니다. 참고: 아래 펜 라이트 핸들을 테이프 또는 이미징 동안 모든 시간에 빛을 유지 하는 고무 밴드를 사용. 이 이미지가 흐릿한 경우 도움이 될. 동료와 함께 이미징 단계를 수행 하는 것이 쉽습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 각 막 마포 후 깨어난
<ol><li>첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 2.1에서 동일한 처리 기술을 사용 합니다.</li>
	<li>항균, fucidin 산 눈 연 고 (Isathal) 수 분 마 취 후 눈 표면 박테리아에서 청결 한 유지 하 침식 및 침식 비 눈 방울을 놓습니다.</li>
	<li>마우스는 온수에 5 ~ 20 분에 일어나 것 이다, 마 취 후 웨이크 업 기간 동안 마우스를 관찰 합니다. 때 모바일, 개별 감 금 소에. 참고: 깨어 오래 걸리면, 온수 패드 장에 마우스를 배치 또는 전체 케이지 온수 접시에 놓고 마우스를 정기적으로 모니터링 합니다. 마 취 기운이 떨어지기, 마우스 일반적으로 착취 하 고 앞쪽 시체와 함께 위쪽으로 도달. 이 문제는 3-4 시간에 정상으로 반환 해야 하 고 공유 감 금 소에 다시 마우스를 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>2.2 단계에서 마찬가지로 마모 후 이틀 연속에 carprofen i.p. 진통와 눈 연 고에 대 한 관리. 그리고 4.2입니다.</li>
</ol>5. 상처 치유 하는 동안 이미징
<ol><li>이 프로토콜에서 사용 시간 상처 폐쇄를 관찰 하는 마모 후 18 h 및 72 h 포인트.<ol>
<li>연속 영상에 대 한 2.2에 설명 된 대로 쥐를 anesthetize.</li>
		<li>3에 설명 된 대로 사진을 찍을.</li>
		<li>Atipamezole i.p.와 동물 그리고 4.3에 설명 된 대로 시동 기간을 모니터링. 참고: 그렇지 않으면 계속 속 행, 5.1.2 후 바로 마우스를 안락사. 안락사는 6.1에 설명 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 각 막 컬렉션 및 파라핀 포함
<ol><li>마지막 시간 이후에, 동물을 희생. CO2로 채울 수 있는 챔버에 마우스를 놓습니다. CO 챔버 공기를 채워2. 동물 모바일 이면 꼬리의 기지에서 단단히 당기 및 동시에 누르고 목 지역 경관 척추를 탈 구. 주의: 항상 로컬 동물 복지 본문의 지침을 따르십시오.</li>
	<li>눈의 해 부가 위 피부에 개방을 절단 하 여 안구 전체를 수집 합니다. 안구에서가 위를 배치 하 고 궤도에서 안구 팝업 눈 신경 절단. 집게를 사용 하 여 눈 오지 않는 경우 밖으로 쉽게.<ol>
<li>눈 안에 솔루션의 무료 침투 수 있도록 26 G 바늘, 망막에 눈의 뒷면에 구멍을 확인 합니다. 참고: 눈 건조, 대신, PBS에 장소는 프로토콜 계속까지 못하게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS 2 mL 튜브에 눈알을 수집 합니다. 실험을 일시이 시점에서 하지 않습니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 4-5 시간 + 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 눈알을 수정.</li>
	<li>고정된 안구 조직 카세트 조직 처리에 대 한 이동 합니다. 조직 처리 기계 및 다음 프로그램을 사용:<ol>
<li>PBS와 린스.</li>
		<li>실 온에서 70% 에탄올에 2 x 45 분을 품 어.</li>
		<li>실 온에서 94% 에탄올에 2 x 1 h를 품 어.</li>
		<li>실 온에서 절대 에타 놀에서 3 x 45 분을 품 어.</li>
		<li>크 실 렌, 실내 온도 37 ° c.에 마지막 자일 렌에서 3 x 1 h을 품 어</li>
		<li>파라핀 왁 스 60 ° c.에 있는 3 x 1 h을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 처리, 후 박을 안구 조직 포함 블록을 사용 하 여 액체 파라핀 (+ 60 ° C). 그것은 옆으로 보고와 주변 테두리를 위쪽으로 향하게 되도록 블록 내 눈을 놓습니다. 5-10 분 동안 차가운 접시에 응고 블록을 보자.</li>
</ol>7. 각 막의 파라핀 섹션
<ol><li>기관의 또는 제조업체의 지침에 따라 단면에 대 한 톰을 준비 합니다. 주의: 날카로운 톰 블레이드를 처리할 때는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>실내 온도 톰 옆에 초순 장소 한 물 탕 다른 초순 + 50 ° c 온수</li>
	<li>안구의 5 µ m 두꺼운 섹션을 확인 합니다. 참고: 렌즈 쉽게 구분 하는 동안 휴식. 이 방지 하려면 절단 표면을 각 시간 섹션의 새로운 행이 시작 촉촉한 티슈로 닦아냅니다. 수돗물을 사용 하 여 조직 축.</li>
	<li>실내 온도 물 목욕에 서로 옆에 섹션을 놓고 뜨거운 물 목욕 유리 슬라이드의 도움으로 이동 합니다. 모든 주름이 이완 될 때까지 뜨거운 물 목욕 및 섹션 될 매트에 섹션을 스트레칭.</li>
	<li>+37 ° C에 하룻밤 단면도 유리 슬라이드를 건조</li>
	<li>슬라이드 + 60 ° C에 온수 접시에 1 분간 유지 하 여 슬라이드에 연결할 섹션 이 후, 섹션 수 수 직접 얼룩, immunohistological 방법에 대 한 처리 또는 + 4 ° C에 저장</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

부상 메서드는 각 막 항상성 및 병 리의 다양 한 측면을 공부 인기 있는 도구입니다. 마모 모델 안과에 관련 문제를 해결 하기 위해 잘 제어 방법을 제공 합니다. 그러나, 특정 중요 한 포인트는 프로토콜에서 강조 가치가 있다. 특히, 수의학, 상처 치유 타임 라인, 그리고 결과 관한 설명 내용을 outbred NMRI와 ICR 주식와 함께 사용 하기 위해 최적화 된 하지만 쥐26의 변종 마다 다를 ?...

수많은 기관의 상피 층 부상에 노출 됩니다. 그러나, 그들은 또한 상처 치유를 통해 조직의 손실을 보상 하는 기능을 포함. 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 그것은 눈의 외부 표면에 형성 하 고 민감한 눈 기계에 대 한 보호 계층을 제공 합니다. 따라서, 각 막 병원 균과 감수를 물리적 장벽 역할을 합니다. 그것은 3 개의 층;으로 구성 상피, 기질 및 피입니다. 각 막의 상피 각 막의 가장 바깥쪽 레이어 최대 수 있습니다. 상피 세포는 단단한 접속점1,2,3통해 서로 엄격 하 게 준수 하 여 각 막의 장벽 기능을 유지 합니다. acellular 막 지하실 막, 보 먼의 막 내 화 keratocytes를 포함 하는 광범위 한 기질에서 상피를 분리 합니다. 기질에서 내 피 세포 영양분, 물, 그리고 산소는 상위 레이어를 채널.
각 막 찰과상은 병원4에서 아주 일반적 이다. 각 막에 상해 다양 하지만 크게 다른 이물질, 스크래치, 또는 모래, 먼지와 같은 작은 입자에 의해 발생. 프로토콜 설명 여기 임상 관련 유형의 각 막 상피 마모를 재현 하는 겨냥 했다. 이렇게,이 프로토콜에는 임상 및 각 막 과학자 들은 자신의 연구에서 구현 하는 제어 및 정액 방법을 제공 한다. 우리 murine 각 막에 무디게 눈 버, Algerbrush II와 조직 abrading 하 여 비보에 부상 수리 분석을 수행 했습니다. 여기, 우리가 대상 중앙 각 막 상피에만 마모 손상 없이 장기의 다른 부분을 떠나. 따라서, 마이그레이션, 확산 및 감 별 법 vivo에서5세포 프로토콜은 다시 epithelialization 동안 연구 각 막 상피 세포 역학 또는 지하실 멤브레인에 이상적 이다. 최근,이 모델 murine 각 막에도 다시 부상6,7후 각 막 줄기 세포 틈새에서 차별화 된 각 막 상피 세포의 용량을 공개로 조상 세포 역학 분석에 사용 되었다. 마모, 다음 각 막의 정상적인 투명성과 인장 강도를 반환합니다. 흥미롭게도, 생체 외에서 연구 표시는 다시 epithelialization 증가 세포 확산8없이 발생 합니다. 이 프로토콜 murine 각 막에 치료 중단의 타임 라인을 설명 합니다. 방법은 따라서 치료 패턴 및 속도에 약물의 효과 테스트에 적용 됩니다.
각 막 상처 치유 연구에 대 한 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 많은 연구는 상해의 다른 모델에 의존 했습니다. 9각 막 표면 필터 종이 없이 각 막 상해의 잘 설립 모델 수산화 나트륨 (NaOH)을 적용 하 여 수행 되는 알칼리 화상 이다. 알칼리 성 노출 영향을 각 막 상피, 뿐만 아니라 뿐만 아니라 결 막 및 기질9,10크고 확산 부상에서 결과입니다. 강한 알칼리 솔루션 각 막 궤 양, opacification, 및9neovascularization 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 염증 세포 6 h 이내 일반적으로 기질을 침략 하 고 24 h11까지 거기 남아 있다. 따라서, 알칼리 성 부상 stromal 활성화에 관련 된 연구에서 권장 방법입니다. 또 다른 유형의 화학 상해 각 막9,10에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 적용 하 여 쏜 수 있습니다. 다른 일반적으로 사용 되 부상 모델 기질14,15의 상단 부분에 제한 되는 기질 및 keratectomy 상처를 통해 침투 incisional 상처 포함 됩니다. 이 메서드는 또한 stromal 상처 치유에 관한 질문에 대답 하는 데 유용. 다른 부상 모형에는 그들의 자신의 장점과 단점 있다. 마모, 또는 각 막 상피의 debridement는 비보 전 각16에 무디게 scalpels 또는 블레이드를 사용 하 여 처음 개발 되었다. 이 방법은 사용 vivo에서 마우스, 쥐, 토끼17,18,19,20,,2122에 나중에 되었습니다. 우리는 상피의 나머지 영향을 받지 떠나는, 상피의 선택된 된 영역만 제거 눈 버 (그림 1)를 사용 하 여. 이러한 방법으로, 그것이 정확 하 게 각 막의 다른 부분에 상피 제거 대상으로 가능 합니다. 또한, 마모 크기 fluorescein 얼룩과 평가 될 수 있다. 또한, 여기에 우리가 치료 기간 동안 마모 폐쇄를 따르십시오.
이 메서드는 몇 가지 장점이 포즈, i)를 포함 하 여 화학 부상으로 불가능 하다, 마모 사이트의 정확한 위치 ii) 마모 수행, 빠른 이며 iii) 그것은 비 침략 적. 그러나 여기, 우리는이 마우스 유전자 모델의 광대 한 배열 뿐만 아니라 쥐와 토끼, 인간의 각 막 장애를 연구 하는 데 사용 하는 일반적인 모델에 적용 될 수 있었다 모델로, outbred NMRI 마우스를 사용 하 여 메서드를 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

Murine 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 각 막, 눈의 가장 바깥쪽 레이어 이며 따라서 부상으로 첫 번째 방어 이다. 사실, 눈 부상 클리닉에서 발견의 가장 일반적인 유형은 각 막 마포 이다. 여기, 우리는 인 제거는 각 막 상피에 vivo에서 쥐를 마 취에 한 마모를 유발 하는 눈 버를 활용 합니다. 이 메서드는 타겟과 재현 상피 중단, 그대로 다른 지역에 대 한 수 있습니다. 또한, 우리 fluorescein 얼룩과 침식된 상피의 시각화를 설명 하 고 각 막이 침식된을 시각화 하는 방법에 구체적인 조언을 제공. 다음, 우리는 상처는 상처는 다시 epithelialized 때까지 0, 18, 및 72 h 마모, 후 치유의 타임 라인을 따른다. 상해 각 막의 상피 마모 모델 상피 세포 증식, 마이그레이션 및 각 막 층의 재 epithelialization에 대 한 연구에 이상적입니다. 그러나,이 방법은 아니다 상처 치유, 동안 stromal 활성화 연구 최적의 눈 버 stromal 세포 층에 침투 하지 않습니다 때문에. 이 메서드는 또한 임상 응용, 약물 효과의 예, 전 임상 시험에 적합.

이 프로토콜 마우스 각 막에 마포 상해를 입힐 수 있는 모델을 설명 하 고 따라 하 고 마모 후 치유 과정을 시각화 방법을 제시. 최근에, 우리는 상처 치유6동안 각 막 상피 조상 세포의 역할을 연구 하기 위해이 메서드를 고용. 설정된 도구를 사용 하 여 성공적인 마모 실험에 열쇠 이다. 우리는, 그리고 다른 찰과상6,,<sup ...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K 조회수.  University of Helsinki. 이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

연구

의학

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

상처 치유의 생쥐 모델

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

치수의의 평가에 대한 직접 펄프 캐핑 모델의 개발 상처 치유와 마우스의 수복 상아질 형성

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

선택적 화학 요 추 신경 절제술의 대상 회색 라미 Communicantes

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...