Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein hochgewebespezifisches Zielexpressionssystem zu erzeugen. Bei dieser Methode demonstrierten wir die Generierung eines binären Transkriptionstreibers speziell für unseren Drosophila FGF Homolog, verzweigt. Dynamische, raumzeitliche Expression von zweiglos reguliert die Asthämogenese des Trachealatemepithels.
Obwohl diese Methode Einen Einblick in die räumlich-zeitliche Expression und Migration von verzweigt produzierenden Zellen geben kann, kann sie leicht auf andere Gene und Gewebe in Drosophila oder in anderen Modellorganismen wie C.Elegans und Zebrafischen angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Expressionssysteme erzeugt, die sehr zuverlässig, gewebe- und genspezifisch sind und ausschließlich in Zellen aktiv sind, in denen die cis-regulatorischen Elemente des ersetzten Gens funktionsfähig sind. Binäre Transkriptionssysteme sind wesentliche Werkzeuge für gezielte Genexpression und -manipulation.
Ein Transaktivator wie GAL4 oder LexA, der unter der Kontrolle von cis regulatorischen Elementen eines Gens ausgedrückt wird, treibt ein Effektor-Transgen an, das nach bestimmten Transkriptionsbindungsstellen, wie UAS für GAL4 und/oder LexO für LexA, nachgelagert ist. Diese Methode ersetzt das erste codierfreie Exon des zweiglosen Gens durch den Transkriptionstreiber. Die CRISPR Cas9-basierte Methode stellt eine LexA-Transaktivatorsequenz unter die endogene Regulation des verzweigten Gens und erleichtert somit die Transaktivatorexpression ausschließlich in verzweigten spezifischen raumzeitlichen Mustern.
Wählen Sie zunächst zwei RNA-Zielsites aus, die speziell auf zwei Enden der ausgewählten Interessenregion abzielen. Öffnen Sie das CRISPR-Designtool Ihrer Wahl. Fly CRISPR Optimal Target Finder wird hier verwendet.
Klicken Sie auf "Genome auswählen" und wählen Sie im Dropdown-Menü die zuletzt hochgeladene Drosophila melanogaster Genom-Anmerkung, derzeit R-Unterstrich sechs, aus. Klicken Sie als Nächstes auf Guide length' auswählen und geben Sie 20 ein. Wählen Sie Alle CRISPR-Ziele aus und klicken Sie auf CRISPR-Ziele suchen.
Bewerten Sie alle Kandidaten-Guide-RNA-Ziele, indem Sie das Maximum für Stringency und NGG only'für PAM festlegen. Um einen Tandem-Führungs-RNA-Expressionsvektor zu erzeugen, verstärken sie zunächst ein DNA-Fragment, um zwei Proto-Spacer-Sequenzen in ein pCFD4-RNA-Expressionsvektor-Backbone einzuführen. Verwenden Sie einen Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit jeweils einer Proto-Abstandssequenz und überlappen Sie sich mit der pCFD4-Vektorsequenz in einer PCR mit High-Fidelity-Polymerase und pCFD4-Vorlagen-DNA.
Um pCFD4 zum Klonen vorzubereiten, verdauen Sie das Plasmid mit dem Enzym Bbs1. Richten Sie eine Reaktion im entsprechenden Verdauungspuffer ein, der zwei bis fünf Mikrogramm pCFD4-Plasmid und einen Mikroliter Bbs1-Enzym und ein Endvolumen von 50 Mikrolitern enthält. Mischen Sie den Reaktionsinhalt, indem Sie das Rohr anzapfen und alle verstreuten Tröpfchen von der Rohrwand nach unten durch eine kurze Drehung sammeln.
Inkubieren Sie den Reaktionsmix bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden nach dem Ausführen des PCR-Produkts und verdaut Plasmid auf einem ein Prozent Agarose-Gel. Reinigen Sie das 6,4 Kilobasis paar lineare Plasmid und 600 Basispaar PCR Produkt mit Standard-Gel-Reinigungssäulen. Richten Sie die DNA-Montagereaktion gemäß dem Herstellerprotokoll ein.
Für das genomische Einschlagen einer GAL4- oder LexA-Sequenz entwerfen Sie einen doppelsträngigen HDR-Spender, der die Transaktivatorsequenz enthält, flankiert von zwei Homologiearmen. Um eine Neuausrichtung der Führungs-RNA auf den konstruierten Lokus zu vermeiden, entwerfen Sie den Ersatzspender so, dass die RNA-Erkennungsstellen des Leitfadens durch die eingeführte exogene Sequenz gestört werden. Um die Reinheit der cis-Regulierungselemente zu vermeiden, wählen Sie immer die Rna-Erkennungsstellen innerhalb der codierenden Exonregion aus, um eine Änderung der Reinheit der cis-Regulierungselemente zu vermeiden.
Um eine Ersatzkassette zu generieren, planen Sie die DNA-Montagestrategie, um vier Segmente miteinander zu verbinden. Die fünf Prim- und drei Prime-Homologie-Arme, die dna-Sequenz des mittleren exogenen Transaktivators und das linearisierte Klonvektor-Rückgrat. PCR verstärken eine GAL4- oder LexA-Expressionskassette aus einem geeigneten Vektor und PCR verstärken die Homologiearme aus der genomischen DNA, die aus der für die Injektion ausgewählten übergeordneten Fliegenlinie extrahiert wurde.
Verwenden Sie High-Fidelity-Polymerase in jeder PCR, um die Zielfragmente zu generieren. Um die DNA-Montagereaktion einzurichten, mischen Sie den linearisierten Klonvektor und die Zielfragmente, die durch PCR-Klonen erzeugt werden, mit dem DNA-Baugruppenmastermix und einem endk.-Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie den Reaktionsmix für eine Stunde bei 50 Grad Celsius.
Wenn Nos-Cas9-Embryonen, die zuvor sowohl mit dem Guide-RNA-Expressionsplasmid als auch mit dem Ersatzspender injiziert wurden, sich zu Erwachsenen entwickeln, kreuzen Sie G0-Fliegen einzeln, um Ihre Fliegen von einer für das Zielallel geeigneten Linie auszugleichen. Anästhetisieren Sie die F1-Nachkommen aus jedem G0-Kreuz auf einem Kohlendioxid-Pad. Wählen Sie zufällig 10 bis 20 Männchen unter einem Stereomikroskop.
Individuell kreuzen Sie jedes ausgewählte Männchen zu einem Balancer Weibchen aus einer Linie, die für das zielgerichtete Allel geeignet ist. Wenn die F2-Larven schlüpfen, wählen Sie den F1-Vater aus jedem Kreuz. Extrahieren Sie genomische DNA, indem Sie jede Fliege 10 bis 15 Sekunden lang mit einer Pipettenspitze zerlegen, die 50 Mikroliter Squishing-Puffer enthält, ohne den Puffer zu dosieren.
Geben Sie dann den restlichen Puffer in das Rohr und mischen Sie ihn gut. Bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten inkubieren. Legen Sie die Rohre nach der Inkubation für ein bis zwei Minuten in einen 95 Grad Celsius-Wärmeblock, um die Proteinase K zu inaktivieren. Nachdem Sie sich fünf Minuten lang bei 10.000 mal G abgedreht haben, lagern Sie die Zubereitung bei vier Grad Celsius für weitere PCR-Analysen.
Führen Sie dreistufige PCR-basierte Bildschirme mit Primern vorwärts und rückwärts eins auf den Bildschirm für das Vorhandensein des Einfügens oder Austauschs. Führen Sie PCR mit zwei Vorwärts- und umgekehrten zwei Primern durch, um das Einfügen oder Ersetzen aus dem drei Primbereich zu überprüfen. Führen Sie PCR mit Primern M13F und umgekehrt drei, um End-in'HDR zu überprüfen.
Halten Sie die Fliegenlinien mit dem bestätigten End-out'HDR und stellen Sie ausgewogene Bestände aus der F2-Generation her. Out-Cross der Balancer fliegt wieder, um alle unbeabsichtigten Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen. Zweiglose, oder bnl Expression, wird hier in rot in der dritten Instar Larven Flügelscheibe gezeigt, mit dem Rezeptor atemlose exprimierende Zellen, in grün dargestellt, in der wachsenden Luft sac primordium.
Zweiglose Exzesszellen werden hier im TR5 Querverbindungszweig und TR2 dorsalen Zweig gezeigt. Atemlose ausdruckende Luftröhrenzellen werden hier grün dargestellt. Atemlose Extierzellen werden grün dargestellt und markieren die sich entwickelnde embryonale Luftröhre vom stadium 9 bis Stadium 14 und die verzweigten exemittierten Zellen sind rot dargestellt.
Dieses Bild zeigt eine verzweigte Expression, die an ektopischen Gewebestellen unter hypoxischen Bedingungen im Verhältnis zur Kontrolle induziert wird. Diese Methode wurde entwickelt, um alle ursprünglichen raumzeitlichen Vorschriften der zweiglosen Gentranskription beizubehalten. Daher war es wichtig, nur das erste codierende Exon des Gens durch die LexA Trans-Aktivator-Codierungssequenz zu ersetzen.
Nach seiner Entwicklung ebnete dieses neue genetische Toolset den Weg, um neuartige Gewebeexpressionsmuster des zweiglosen Gens zu erforschen. Es ermöglichte auch Gen-Fehlexpression und klopfte ausschließlich in verzweigten expressionszellen und half bei der Überwachung der linearen Migration und Signalinteraktionen der Zellen.
