Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen in hepatotropen Infektionen und Lebererkrankungen Felder zu beantworten. Wie der Beitrag von Leber-Resident-Zellpopulationen, zu viraler Pathogenese, Längsinfektionskinetik, Mechanismen der Virusreplikation, Immuninvasion, in einem physiologischen Modellsystem und Medikamententests. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, eine leberische Mikroumgebung zu rekapitulieren.
Die über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden kann und natürlich anfällig für Hepatitis-B-Infektionen auf physiologisch relevanten Ebenen ist. Dies war bisher ein grundlegendes Hindernis im Bereich Hepatitis B. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie oder Diagnose von HBV-Infektionen, da Arzneimitteltests in einer physiologischen Plattform für längere Zeit durchgeführt werden können.
Dies ermöglicht die Bewertung sequenzieller medikamentöser Behandlungen sowie die Analyse der Wirksamkeit bestehender und neuartiger Behandlungsstrategien. Diese Methode kann Verständnis in Hepatitis B bieten, und kann auch auf andere Studien der Krankheit angewendet werden, einschließlich anderer hepatotroper Infektionen, Lebererkrankungen, oder Arzneimittelstoffwechselstudien. Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird kämpfen, weil es die Aufmerksamkeit auf bestimmte Details erfordert, um die erfolgreiche Wartung von Lebergewebe für längere Zeit zu ermöglichen.
Und auch mit den spezialisierten Werkzeugen und Geräten vertraut zu machen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Einschließlich Montage der Platten sowie Auftauen und Säen der Zellen.
Da Schritte in der langfristigen Kultur der Leber-abgeleiteten Zellen beteiligt sind eine Herausforderung, wenn ein neuartiges Kultursystem zu verwenden. Schalten Sie zunächst sowohl den Kompressor als auch die Vakuumpumpe ein, die mit der Leberchipplattform verbunden ist. Fahren Sie mit einem Glasrohrschrank fort, um die Platten zu montieren und auszudemtzubilden.
Legen Sie eine sterile Membran auf die Plattenbasis, um mit der aseptischen Montage der mikrofluidischen Platten zu beginnen. Sicherstellen, dass die sterile Membran reibungslos auf den beiden Stiften der Grundplatte ruht. Dann fügen Sie die gut enthaltende obere Platte hinzu.
Fügen Sie einen sterilen Plattendeckel hinzu. Und verwenden Sie ein automatisiertes Präzisionsdrehmoment, das auf 33 Pfund eingestellt ist. Mit einer Spiralstrafungssequenz, um die Schrauben an der Basis der Platte festzuziehen.
Achten Sie mit einem manuellen Drehmoment darauf, dass alle Schrauben auf 35 Pfund angezogen sind. Als nächstes die Hepatozyten-Saat mittlere auf 37 Grad Celsius vor dem Anheizen vorwärmen. Legen Sie die komplett montierte Platte in die Waschbank.
Und stellen Sie sicher, dass die Platte vollständig einrastet. Fügen Sie 400 Mikroliter Hepatozyten-Saatmedium auf die Reservoirseite jedes Brunnens, um die Platte zu grundieren. Danach den Fluss in aufwärts für 3,5 Minuten bei einem Mikroliter pro Sekunde initiieren.
Die roten Anzeigen an der Seite der Platte zeigen an, ob die mikrofluidische Zirkulation ordnungsgemäß funktioniert. Sobald das Medium auf die Zellwachstumsseite der Platte gepumpt wird, fügen Sie weitere 1,2 Milliliter Hepatozyten-Saatmedium hinzu. Übertragen Sie die Platte vorsichtig in die Dockingstation innerhalb eines befeuchteten Inkubators bei 37 Grad Celsius und 5%CO2.
Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 16 Stunden. Danach die Platte auf eine Waschbank geben. Sanfte Pipette nach oben und unten, um Blasen zu beseitigen.
Mit einer sterilen Zange, fügen Sie ein steriles rundes Filterpapier zu jedem Brunnen. Fügen Sie dann jedem Brunnen ein Zellbefestigungsgerüst und einen Haltering hinzu. Verwenden Sie einen sterilen Kolben, um jeden Brunnen nach unten zu drücken und die Halteringe und Gerüste an Ort und Stelle zu verriegeln.
Als nächstes aspirieren Sie das gesamte Medium. Und sanft 400 Mikroliter vorgewärmtes Hepatozyten-Saatmedium über das Gerüst geben. Initiieren Sie den Fluss in einer Abwärtsrichtung bei einem Mikroliter pro Sekunde für 3 1/2 Minuten.
Aspirieren Sie alle Mittel aus der Reservoirseite der Platte gepumpt. Fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten-Saatmedium zu jedem Brunnen hinzu. Dann geben Sie die Platte an das Dock zurück, um das Gesamtvolumen pro Brunnen auf bis zu 1,6 Milliliter zu bringen.
Zuerst das Hepatozytenauftaumedium und Hepatozytensäen mittel auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Als nächstes tauen Sie eine Durchstechflasche mit primären menschlichen Hepatozyten nach den Anweisungen des Lieferanten auf. In einem Glasrohrschrank die Zellen in einem Milliliter Hepatozyten-Saatmedium wieder aussetzen.
Dann legen Sie die resuspendedn Zellen auf Eis. Mit Trypanblau, zählen Sie die Zellen, um sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen über 90% Übertragen Sie die vollständig montierte Platte auf das Waschbecken. Und alle Medien aus den Brunnen aspirieren.
Holen Sie die Zellen aus dem Eis, und fügen Sie 600.000 Hepatozyten zu jedem Brunnen in einem 500-Mikroliter Volumen von Hepatozyten-Saatmedium. Initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde. Fügen Sie 900 Mikroliter Hepatozyten-Saatmedium zu jedem Brunnen, um das Gesamtvolumen in jedem auf 1,6 Milliliter zu bringen.
Übertragen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und mit 5% CO2 zur Dockingstation. Initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für acht Stunden. Danach kehren Sie den Fluss mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für acht Stunden in die Aufwärtsrichtung um.
Dann die Platte auf die Waschstation übertragen, und aspirieren alle Medium aus den Brunnen. Fügen Sie 400 Mikroliter Hepatozyten-Wartungsmedium zu jedem Brunnen hinzu. Und initiieren Sie den Fluss in abwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 3 1/2 Minuten.
Als nächstes, aspirieren Sie alle Medium aus dem Reservoir, und fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten Wartungsmedium. Übertragen Sie die Platte in die Dockingstation in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 48 Stunden.
Waschen Sie den Teller nach 48 Stunden, indem Sie ihn auf das Waschbecken übertragen. Aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen. Und fügen Sie 400 Mikroliter Wartungsmedium hinzu.
Und initiieren Sie den Fluss in Abwärtsrichtung bei einem Mikroliter pro Sekunde für 3,5 Minuten. Dann aspirieren Sie alle Medium erscheinen in der Reservoir-Seite der Brunnen. Fügen Sie 1,4 Milliliter Hepatozyten-Wartungsmedium hinzu.
Dann die Platte zurück zur Dockingstation im befeuchteten Inkubator geben. Initiieren Sie den Fluss in aufwärts mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde für 48 Stunden. Ersetzen Sie das Medium mit diesem Wasch-und-Austausch-Prozess alle 48 Stunden.
Primäre menschliche Hepatozyten sind in der Regel nur für einen begrenzten Zeitraum stabil, wenn herkömmliche Kultursysteme verwendet werden. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können sie jedoch über einen längeren Zeitraum funktional gepflegt werden. Humanalbumin wird von funktionellen Hepatozyten abgesondert und gilt als der beste Marker für die Bewertung der Leberfunktionalität.
Albumin wird von 3D-Kulturen bis mindestens Tag 40 nach der Aussaat stabil und stark ausgedrückt. Für Kokulturen werden die Funktionalität und Lebensfähigkeit von Kupffer-Zellen durch Messung der Sekretion bestimmter Zytokine bewertet. Wie hier zu sehen, zeigen die gemessenen Werte von IL-6 und TNF alpha, dass Zellen funktionell erhalten und lebensfähig waren.
Neben der Beibehaltung ihres physiologischen Zellstoffwechsels wurden diese Kulturen außergewöhnlich anfällig für HBV-Infektionen. HBV-DNA und andere virale Marker sind ab Tag zwei nach der Infektion leicht nachweisbar. Während konventionelle Kulturen eine Impfung mit mindestens 500 HBV-Genomäquivalenten erfordern, die mit DMSO und PEG ergänzt werden, sind diese 3D-Kulturen mit nur 05 unergänzenden Genomäquivalenten infiziert.
Neben sezernierten Markern einer Virusinfektion werden hepatozytenhaltige Gerüste aus diesen Kulturen gewonnen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt, dass diese Gerüste virale Antigene enthalten. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, sanft zu sein, wenn der Umgang mit den Hepatozyten vor der Aussaat, um Zelltod zu vermeiden.
Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Platten richtig montiert sind und alle Durchflusskanäle eine korrekte Medienzirkulation ermöglichen, bevor die Hepatozyten gesät werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Einschließlich der Lage und Häufigkeit der infizierten Zellen im Gewebe.
Der physiologische Zustand der Hepatozyten kann auch durch Färbung für Albumin- oder Leberstrukturen einschließlich des engen Knotenproteins ZO-1 beurteilt werden. Nach dieser Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Virologie, um Hepatitis-B-Infektionen und Immunantworten in einem physiologischen 3D-Modellsystem zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-B-Virus gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie vorherige Impfungen, die Verwendung geeigneter PSA und die Arbeit unter geeigneten Biosicherheitsrichtlinien sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
