שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בזיהומים hepatotropic ושדות מחלת כבד. כגון תרומתן של אוכלוסיות תאים תושבות כבד, לפתוגנזה ויראלית, קינטיקה של זיהום אורך, מנגנונים של שכפול ויראלי, פלישה חיסונית, במערכת מודל פיזיולוגית ובדיקות סמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לכבוש מחדש microenvironment בשבח.
אשר יכול להישמר לפרקי זמן ממושכים והוא רגיש באופן טבעי לזיהום הפטיטיס B ברמות רלוונטיות פיזיולוגיות. זה היה בעבר אילוץ בסיסי בשדה הפטיטיס B. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת טיפול או אבחון של זיהום HBV כי מחקרים בדיקות סמים יכול להתבצע בפלטפורמה פיזיולוגית עבור משכי זמן ארוכים.
זה מאפשר הערכה של טיפולים תרופתיים רציפים לצד ניתוח היעילות של אסטרטגיות טיפול קיימות ורומן. שיטה זו יכולה לספק הבנה לתוך הפטיטיס B, והוא יכול להיות מיושם גם על מחקרים אחרים של המחלה, כולל זיהומים hepatotropic אחרים, מחלות כבד, או מחקרים חילוף החומרים של התרופה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי זה דורש תשומת לב לפרטים מסוימים כדי לאפשר תחזוקה מוצלחת של רקמת הכבד במשך פרקי זמן ארוכים.
וגם היכרות עם הכלים והציוד המיוחדים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. כולל הרכבה של הצלחות, כמו גם הפשרה זרע של התאים.
מאז צעדים המעורבים בתרבות ארוכת הטווח של תאים שמקורם בכבד הם מאתגרים בעת שימוש במערכת תרבות חדשנית. ראשית, הפעל הן את המדחס והן את משאבת הוואקום הקשורה לפלטפורמת שבבי הכבד. המשיכו לארון צינור זכוכית כדי להרכיב ולהאיב את הצלחות.
מניחים קרום סטרילי על בסיס הלוח כדי להתחיל בהרכבה בלתי מיומנות של הלוחות המיקרופלואידיים. מוודאים שהממברנה הסטרילית מונחת בצורה חלקה על שני הפינים של לוחית הבסיס. לאחר מכן הוסיפו את הצלחת העליונה המכילה היטב.
מוסיפים מכסה צלחת סטרילי. ולהשתמש במומנט דיוק אוטומטי, מוגדר ל 33 ק"ג. באמצעות רצף הידוק ספירלי להדק את הברגים בבסיס הצלחת.
באמצעות ממנט ידני, ודא שכל הברגים מהודקים ל-35 פאונד. לאחר מכן, מחממים מראש את זריעת ההפטוציט בינונית עד 37 מעלות צלזיוס לפני ההטיה. מניחים את הצלחת שהורכבה לחלוטין ברציף הכביסה.
ותוודא שהצלחת תישבר לגמרי. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מדיום זריעת hepatocyte לצד המאגר של כל באר כדי להפוך את הצלחת. לאחר מכן, ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה במשך 3.5 דקות ב microliter אחד לשנייה.
האינדיקטורים האדומים בצד הצלחת יציינו אם זרימת המיקרופלואידית מתפקדת כראוי. לאחר המדיום נשאב לצד צמיחת התא של הצלחת, להוסיף 1.2 מיליליטר נוספים של מדיום זריעת hepatocyte. מעבירים בזהירות את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 16 שעות. לאחר מכן, מעבירים את הצלחת לרציף כביסה. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לחסל את כל הבועות.
באמצעות מדפים סטריליים, הוסף נייר סינון עגול סטרילי לכל באר. לאחר מכן הוסיפו פיגום עם חיבור תא וטבעת שמירה לכל באר. השתמש בוכנה סטרילית לדחוף למטה כל באר ולנעול את הטבעות תמך פיגומים למקומם.
לאחר מכן, שאף את כל המדיום. ומוסיפים בעדינות 400 מיקרוליטרים של זריעת הפטוציט מחוממת מראש על הפיגום. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה ב microliter אחד לשנייה במשך 3 1/2 דקות.
שאפו את כל המדיום נשאב מהצד המאגר של הצלחת. הוסף 1.4 מיליליטר של זריעת hepatocyte בינוני לכל באר. לאחר מכן להחזיר את הצלחת לרציף להביא את הנפח הכולל ל הבאר עד 1.6 מיליליטר.
ראשית, מחממים מראש את מדיום ההפשרה של ההפטוציט ואת זריעת ההפטוציט בינונית עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להפשיר בקבוקון אחד של hepatocytes האדם העיקרי על פי הוראות הספק. בארון צינור זכוכית, תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום זריעת הפטוציט.
לאחר מכן מניחים את התאים המתווסכלים על קרח. באמצעות כחול טריפאן, ספור את התאים כדי להבטיח שהכדאיות של התאים היא מעל 90%העבר את הצלחת שהורכבה במלואה לרציף הכביסה. ושוכם את כל המדיום מה בארות.
לאחזר את התאים מהקרח, ולהוסיף 600, 000 hepatocytes לכל באר בנפח 500 מיקרוליטר של מדיום זריעת hepatocyte. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה. הוסף 900 מיקרוליטרים של זריעת hepatocyte בינוני לכל באר כדי להביא את הנפח הכולל בכל אחד 1.6 מיליליטר.
מעבירים את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך שמונה שעות. לאחר מכן, הפוך את הזרימה לכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה למשך שמונה שעות.
לאחר מכן מעבירים את הצלחת לרציף הכביסה, ושוטפים את כל המדיום מה בארות. הוסף 400 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה hepatocyte לכל באר. וליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה למשך 3 וחצי דקות.
לאחר מכן, שאפו את כל המדיום מהמאגר, והוסיפו 1.4 מיליליטר של מדיום תחזוקת הפטוציט. מעבירים את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 48 שעות.
לאחר 48 שעות, לשטוף את הצלחת על ידי העברתו לרציף הכביסה. שאף את כל המדיום מה בארות. ותוסיף 400 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה.
וליזום זרימה בכיוון כלפי מטה במיקרוליטר אחד לשנייה למשך 3.5 דקות. ואז שאף את כל המדיום המופיע בצד המאגר של בארות. הוסף 1.4 מיליליטר של מדיום תחזוקה hepatocyte.
ואז להעביר את הצלחת בחזרה לתחנת העגינה באינקובטור לח. ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 48 שעות. החלף את המדיום באמצעות תהליך שטיפה והחלפה זה כל 48 שעות.
hepatocytes האנושי העיקרי הם בדרך כלל רק יציב במשך כמות מוגבלת של זמן בעת שימוש במערכות תרבות קונבנציונליות. עם זאת, באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, הם יכולים להישמר באופן פונקציונלי לפרקי זמן ארוכים. אלבומין אנושי מופרש על ידי hepatocytes פונקציונלי, והוא נחשב הסמן הטוב ביותר להערכת תפקודי hepatic.
אלבומין נתפס להיות דקירה מאוד לידי ביטוי על ידי תרבויות 3D עד לפחות יום 40 לאחר הזריעה. עבור תרבויות אחרות, הפונקציונליות והכדאיות של תאי קופפר מוערכות על ידי מדידת הפרשת ציטוקיניות ספציפיות. כפי שניתן לראות כאן, הרמות הנמדדות של IL-6 ו- TNF אלפא מצביעות על כך שהתאים נשמרו באופן תפקודי ובר קיימא.
בנוסף לשמירה על חילוף החומרים התאי הפיזיולוגי שלהם, תרבויות אלה הפכו רגישים במיוחד לזיהום HBV. דנ"א HBV וסמנים ויראליים אחרים ניתנים לזיהוי בקלות מהיום השני שלאחר ההדבקה. בעוד תרבויות קונבנציונליות דורשות חיסון עם לפחות 500 HBV המקבילות הגנום בתוספת DMSO ו PEG, תרבויות 3D אלה נגועים עם מעט כמו 05 מקבילות גנום unsupplemented.
בנוסף לסמנים מופרשים של זיהום ויראלי, פיגומים המכילים hepatocyte מאוחזרים מתרבויות אלה. מיקרוסקופיה Immunofluorescence מגלה כי פיגומים אלה מכילים אנטיגנים ויראליים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין בעת טיפול hepatocytes לפני הזריעה כדי למנוע מוות של תאים.
בנוסף, חיוני לוודא כי הלוחות מורכבים כראוי וכל ערוצי הזרימה מאפשרים זרימת מדיה נכונה לפני זריעת hepatocytes. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שפעת חיסונית על מנת לענות על שאלות נוספות. כולל המיקום והתדירות של תאים נגועים בתוך הרקמה.
המצב הפיזיולוגי של hepatocytes ניתן להעריך גם על ידי כתמים עבור אלבומין או מבנים בהיפוך כולל חלבון צומת הדוק ZO-1. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הווירולוגיה לחקור זיהום הפטיטיס B ותגובות חיסוניות במערכת מודל תלת מימד פיזיולוגית. אל תשכח כי עבודה עם וירוס הפטיטיס B יכול להיות מסוכן, ואמצעי זהירות כגון חיסון קודם, השימוש PPE המתאים, ועובד תחת הנחיות בטיחות ביולוגית מתאימות תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
