Bu yöntem hepatotropik enfeksiyonlar ve karaciğer hastalığı alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Karaciğer yerleşik hücre popülasyonlarının viral patogenezi, boyuna infeksiyon kinetiği, viral replikasyon mekanizmaları, immün invazyon, fizyolojik model sistem ve ilaç testi çalışmalarına katkısı gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı hepatik mikroortamı özetleyebilme yeteneğidir.
Uzun süre korunabilen ve fizyolojik olarak hepatit B enfeksiyonuna doğal olarak duyarlı dır. Bu daha önce hepatit B alanında temel bir kısıtlama olmuştur. Bu tekniğin etkileri HBV enfeksiyonunun tedavisine veya tanısına kadar uzanır, çünkü ilaç testi çalışmaları uzun süre fizyolojik bir platformda yapılabilir.
Bu, mevcut ve yeni tedavi stratejilerinin etkinliğini analiz etmekle birlikte sıralı ilaç tedavilerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu yöntem hepatit B içine anlayış sağlayabilir, ve aynı zamanda diğer hepatotropik enfeksiyonlar da dahil olmak üzere hastalığın diğer çalışmalara uygulanabilir, karaciğer hastalıkları, veya ilaç metabolizması çalışmaları. Karaciğer dokusunun uzun süre başarılı bir şekilde sürdürülmesine olanak sağlamak için belirli ayrıntılara dikkat gerektirdiğinden, genellikle bu yönteme yeni gelen bireyler mücadele edecektir.
Ve aynı zamanda özel araç ve ekipman aşinalık. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Tabakların montajı, hücrelerin çözülmesi ve tohumlanması da dahil.
Karaciğer kaynaklı hücrelerin uzun vadeli kültür dahil adımlar yeni bir kültür sistemi kullanırken zor olduğundan. İlk olarak, hem kompresör ve vakum pompası karaciğer çip platformu ile ilişkili açın. Plakaları monte etmek ve dengelemek için cam bir tüp dolabına ilerleyin.
Mikroakışkan plakaları aseptik olarak monte etmeye başlamak için plaka tabanına steril bir membran yerleştirin. Steril membranın taban plakasının iki pimi üzerinde düzgün bir şekilde dayandığından emin olun. Sonra iyi içeren üst plaka ekleyin.
Steril bir plaka kapağı ekleyin. Ve otomatik bir hassas tork kullanın, 33 pound olarak ayarlayın. Plakanın tabanındaki vidaları sıkmak için spiral sıkma sırası kullanmak.
Manuel tork kullanarak, tüm vidaların 35 pound'a kadar sıkılmış olduğundan emin olun. Daha sonra, önceden ısıtın hepatosit tohumlama orta için 37 santigrat santigrat astar önce. Tamamen monte edilmiş plakayı yıkama yuvasına yerleştirin.
Ve plakanın tamamen içeri yediğinden emin ol. Plakaa asal olarak her kuyunun rezervuar tarafına 400 mikrolitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyin. Bundan sonra, saniyede bir mikrolitre de 3,5 dakika yukarı yönde akış başlatın.
Plakanın kenarındaki kırmızı göstergeler mikroakışkan dolaşımın düzgün çalışıp çalışmadığını gösterir. Orta plaka hücre büyüme tarafına pompalanır sonra, hepatosit tohumlama orta ek 1,2 mililitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna dikkatlice aktarın.
16 saat boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın. Bundan sonra, bir yıkama rıhtımına plaka aktarın. Yavaşça herhangi bir kabarcıklar ortadan kaldırmak için yukarı ve aşağı pipet.
Steril bir forceps kullanarak, her kuyuya steril yuvarlak filtre kağıdı ekleyin. Sonra her kuyuya bir hücre ek iskelesi ve bir istinat halkası ekleyin. Her iyi aşağı itmek ve yerine istinat halkaları ve iskeleler kilitlemek için steril bir piston kullanın.
Sonra, tüm orta aspire. Ve yavaşça iskele üzerinde önceden ısıtılmış hepatosit tohumlama orta 400 mikrolitre ekleyin. 3 1/2 dakika boyunca saniyede bir mikrolitre aşağı doğru akışı başlatın.
Plakanın rezervuar tarafında pompalanan tüm orta aspire. Her kuyuya 1,4 mililitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyin. Daha sonra 1,6 mililitreye kadar kuyu başına toplam hacmi getirmek için plakayı rıhtıma geri döndürün.
İlk olarak, hepatosit eritme orta ve hepatosit tohumlama orta 37 santigrat ısıtın önceden ısıtın. Daha sonra, tedarikçinin talimatlarına göre birincil insan hepatositbir şişe eritme. Bir cam tüp dolap, hepatosit tohumlama orta bir mililitre hücreleri resuspend.
Sonra yeniden askıya alınan hücreleri buza yerleştirin. Trypan mavisi kullanarak, hücrelerin canlılığının %90'ın üzerinde olduğundan emin olmak için hücreleri sayın Tam olarak monte edilmiş plakayı yıkama yuvasına aktarın. Ve kuyulardan tüm orta aspire.
Hücreleri buzdan alın ve her kuyuya 500 mikrolitrelik hepatosit tohumlama ortamına 600.000 hepatosit ekleyin. Saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında aşağı doğru akışı başlatın. Her kuyuya 900 mikrolitre hepatosit tohumlama ortamı ekleyerek her bir kuyudaki toplam hacmi 1,6 mililitreye getirin.
Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna aktarın. Sekiz saat boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızında aşağı doğru akışı başlatın. Bundan sonra, sekiz saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızıyla yukarı doğru akışı tersine çevirin.
Daha sonra plakayı yıkama yuvasına aktarın ve kuyulardan tüm ortamı aspire edin. Her kuyuya 400 mikrolitre hepatosit bakım ortamı ekleyin. Ve 3,5 dakika boyunca saniyede bir mikrolitrelik bir akış hızıyla aşağı doğru akışı başlatın.
Sonra, rezervuar tüm orta aspire ve hepatosit bakım ortamı 1.4 mililitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirme istasyonuna aktarın. 48 saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın.
48 saat sonra, çamaşır yuvasına aktararak plakayı yıkayın. Kuyulardan tüm orta aspirat. Ve 400 mikrolitre bakım ortamı ekleyin.
Ve saniyede bir mikrolitrede 3,5 dakika boyunca aşağı doğru akışı başlatın. Daha sonra kuyuların rezervuar tarafında görünen tüm ortamı aspire edin. Hepatosit bakım ortamı 1.4 mililitre ekleyin.
Daha sonra plakayı nemli kuluçka makinesindeki yanaşma istasyonuna geri aktarın. 48 saat boyunca saniyede bir mikrolitre lik bir akış hızında yukarı yönde akışı başlatın. Bu yıkama ve değiştirme işlemini kullanarak ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
Birincil insan hepatositler genellikle konvansiyonel kültür sistemleri kullanırken zaman sınırlı bir süre için sadece istikrarlı. Ancak, burada açıklanan protokol kullanılarak, işlevsel olarak uzun süreler boyunca muhafaza edilebilir. İnsan albuminfonksiyonel hepatositler tarafından salgılanır ve hepatik işlevselliği değerlendirmek için en iyi belirteç olarak kabul edilir.
Albumin en az 40 post-seeding gününe kadar 3D kültürler tarafından stably ve yüksek ifade olarak görülür. Ortak kültürler için, Kupffer hücrelerinin işlevselliği ve canlılığı belirli sitokinlerin salgısını ölçerek değerlendirilir. Burada görüldüğü gibi, IL-6 ve TNF alfa ölçülen düzeyleri hücrelerin işlevsel olarak korunur ve canlı olduğunu göstermektedir.
Fizyolojik hücresel metabolizmalarını korumanın yanı sıra, bu kültürler HBV enfeksiyonuna karşı son derece duyarlı hale geldi. HBV DNA ve diğer viral belirteçler kolayca gün iki post-enfeksiyon dan tespit edilebilir. Konvansiyonel kültürler DMSO ve PEG ile desteklenen en az 500 HBV genom eşdeğeri ile aşılama gerektirirken, bu 3B kültürler 05 ekimemiş genom eşdeğeri kadar az enfekte olur.
Viral enfeksiyonun salgılanan belirteçlerine ek olarak, hepatosit içeren iskeleler bu kültürlerden alınır. İmmünofloresan mikroskopisi bu iskelelerin viral antijenler içerdiğini ortaya koymaktadır. Bu prosedürü çalışırken, hücre ölümü önlemek için tohumlama önce hepatositler ele nazik olmayı unutmayın önemlidir.
Ayrıca, plakaların doğru bir şekilde monte edilmesini ve tüm akış kanallarının hepatositleri tohumlamadan önce doğru ortam dolaşımına izin verdiğinden emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben ek soruları cevaplamak için immünoreskence gibi başka yöntemler de uygulanabilmektedir. Doku içindeki enfekte hücrelerin yeri ve sıklığı da dahil.
Hepatositlerin fizyolojik durumu da sıkı kavşak proteini ZO-1 dahil albumin veya hepatik yapılar için boyama ile değerlendirilebilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, viroloji alanındaki araştırmacıların fizyolojik 3D model sisteminde hepatit B enfeksiyonunu ve bağışıklık yanıtlarını keşfetmelerinin önünü açar. Hepatit B virüsü ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve önceki aşılama, uygun PPE kullanımı ve uygun biyogüvenlik yönergeleri altında çalışma gibi önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.
