Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em infecções hepatotrópicas e campos de doenças hepáticas. Como a contribuição de populações de células residentes hepáticas, para a patogênese viral, cinética de infecção longitudinal, mecanismos de replicação viral, invasão imunológica, em um sistema de modelo fisiológico e estudos de teste de drogas. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de recapitular um microambiente hepático.
Que pode ser mantido por longos períodos de tempo e é naturalmente suscetível à infecção por hepatite B em níveis fisiológicos relevantes. Isso já foi uma restrição fundamental no campo da hepatite B. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia ou diagnóstico da infecção por HBV porque estudos de testes medicamentosos podem ser realizados em uma plataforma fisiológica por longas duraçãos.
Isso permite a avaliação de tratamentos medicamentosos sequenciais, juntamente com a análise da eficácia das estratégias de tratamento existentes e novas. Este método pode fornecer compreensão sobre a hepatite B, e também pode ser aplicado a outros estudos da doença, incluindo outras infecções hepatotrópicas, doenças hepáticas ou estudos de metabolismo medicamentoso. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, pois requer atenção a detalhes específicos para permitir a manutenção bem sucedida do tecido hepático por longos períodos de tempo.
E também familiarização com as ferramentas e equipamentos especializados. A demonstração visual deste método é crítica. Incluindo montagem das placas, bem como descongelamento e semeadura das células.
Uma vez que as etapas envolvidas na cultura de longo prazo das células derivadas do fígado são desafiadoras ao usar um novo sistema cultural. Primeiro, ligue o compressor e a bomba de vácuo associada à plataforma do chip de fígado. Vá para um armário de tubo de vidro para montar e equilibrar as placas.
Coloque uma membrana estéril na base da placa para começar a montar as placas microfluídicas. Certificando-se de que a membrana estéril repousa suavemente sobre os dois pinos da placa base. Em seguida, adicione a placa superior bem contendo.
Adicione uma tampa de placa estéril. E use um torque de precisão automatizado, definido para 33 libras. Usando uma sequência de aperto em espiral para apertar os parafusos na base da placa.
Usando um torque manual, certifique-se de que todos os parafusos estão apertados a 35 libras. Em seguida, pré-aqueça a semeadura de hepatócitos de médio a 37 graus Celsius antes de priming. Coloque a placa completamente montada na doca de lavagem.
E certifique-se de que a placa se encaixa completamente. Adicione 400 microliters de hepatócitos médios ao lado do reservatório de cada poço para preparar a placa. Depois disso, inicie o fluxo na direção ascendente por 3,5 minutos a um microliter por segundo.
Os indicadores vermelhos na lateral da placa indicarão se a circulação microfluidica está funcionando corretamente. Uma vez que o meio seja bombeado para o lado de crescimento celular da placa, adicione um adicional de 1,2 mililitros de meio de semeadura hepatócida. Transfira cuidadosamente a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2.
Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 16 horas. Depois disso, transfira a placa para uma doca de lavagem. Pipeta suavemente para cima e para baixo para eliminar quaisquer bolhas.
Usando um fórceps estéril, adicione um papel filtro redondo estéril a cada poço. Em seguida, adicione um andaime de fixação celular e um anel de retenção a cada poço. Use um êmbolo estéril para empurrar cada poço e bloquear os anéis de retenção e andaimes no lugar.
Em seguida, aspirar todo o meio. E adicione suavemente 400 microliters de meio de semeadura de hepatócito pré-aquecido sobre o andaime. Inicie o fluxo em direção descendente a um microliter por segundo durante 3 minutos e meio.
Aspire todos os meios bombeados para fora do lado do reservatório da placa. Adicione 1,4 mililitros de hepatocitado semeando meio a cada poço. Em seguida, devolva a placa para a doca para trazer o volume total por poço até 1,6 mililitros.
Primeiro, pré-aqueça o meio de descongelamento de hepatócitos e a semeadura de hepatocitte de média a 37 graus Celsius. Em seguida, descongele um frasco de hepatócitos humanos primários de acordo com as instruções do fornecedor. Em um armário de tubo de vidro, resuspenque as células em um mililitro de meio de semeadura hepatócida.
Em seguida, coloque as células resuspended no gelo. Usando o azul trypan, conte as células para garantir que a viabilidade das células esteja acima de 90% Transfira a placa totalmente montada para a doca de lavagem. E aspirar todos os meios dos poços.
Recupere as células do gelo, e adicione 600.000 hepatócitos a cada poço em um volume de 500 microliter de meio de semeadura de hepatócitos. Iniciar fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo. Adicione 900 microliters de meio de semeadura de hepatócitos a cada poço para trazer o volume total em cada um para 1,6 mililitros.
Transfira a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e com 5% de CO2. Inicie o fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante oito horas. Depois disso, inverta o fluxo para a direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante oito horas.
Em seguida, transfira a placa para a doca de lavagem, e aspire todos os meios dos poços. Adicione 400 microliters de meio de manutenção hepatocitar a cada poço. E iniciar fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo por 3 minutos e meio.
Em seguida, aspire todos os meios do reservatório, e adicione 1,4 mililitros de meio de manutenção hepatocitar. Transfira a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2. Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 48 horas.
Depois de 48 horas, lave a placa transferindo-a para a doca de lavagem. Aspire todos os meios dos poços. E adicione 400 microliters de meio de manutenção.
E iniciar fluxo na direção descendente a um microliter por segundo por 3,5 minutos. Em seguida, aspire todos os meios que aparecem no lado do reservatório dos poços. Adicione 1,4 mililitros de meio de manutenção hepatocitar.
Em seguida, transfira a placa de volta para a estação de acoplamento na incubadora umidificada. Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 48 horas. Substitua o meio usando este processo de lavagem e substituição a cada 48 horas.
Hepatócitos humanos primários são geralmente apenas estáveis por um período limitado de tempo ao usar sistemas de cultura convencionais. No entanto, usando o protocolo aqui descrito, eles podem ser mantidos funcionalmente por longos períodos de tempo. A albumina humana é secretada por hepatócitos funcionais, e é considerada o melhor marcador para avaliar a funcionalidade hepática.
Albumina é visto como sendo estável e altamente expresso por culturas 3D até pelo menos o dia 40 pós-semeadura. Para co-culturas, a funcionalidade e a viabilidade das células Kupffer são avaliadas medindo a secreção de citocinas específicas. Como visto aqui, os níveis medidos de IL-6 e TNF alfa indicam que as células foram funcionalmente mantidas e viáveis.
Além de reter seu metabolismo celular fisiológico, essas culturas tornaram-se excepcionalmente suscetíveis à infecção pelo HBV. O DNA HBV e outros marcadores virais são facilmente detectáveis desde o segundo dia pós-infecção. Enquanto culturas convencionais requerem inoculação com pelo menos 500 equivalentes de genoma HBV complementados com DMSO e PEG, essas culturas 3D são infectadas com apenas 05 equivalentes de genoma não-upplementados.
Além de marcadores secretos de infecção viral, andaimes contendo hepatócitos são recuperados dessas culturas. A microscopia de imunofluorescência revela que esses andaimes contêm antígenos virais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ser gentil ao lidar com os hepatócitos antes de semear para evitar a morte celular.
Além disso, é essencial garantir que as placas estejam corretamente montadas e todos os canais de fluxo estejam permitindo a circulação correta da mídia antes da semeadura dos hepatócitos. Após esse procedimento, outros métodos como a imunofluorescência podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Incluindo a localização e frequência de células infectadas dentro do tecido.
O estado fisiológico dos hepatócitos também pode ser avaliado pela coloração para albumina ou estruturas hepáticas, incluindo proteína de junção apertada ZO-1. Após esse desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de virologia explorarem a infecção por hepatite B e respostas imunológicas em um sistema modelo 3D fisiológico. Não se esqueça que trabalhar com o vírus da hepatite B pode ser perigoso, e precauções como vacinação prévia, uso de EPI apropriado e trabalho sob diretrizes adequadas de biossegurança devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
