Die Methode, die wir hier entwickelt haben, hat sich als äußerst nützlich in unserer Arbeit erwiesen, versucht, die molekularen Mechanismen der Sekretion von Hormonen aus dem Darm, aber auch Absorption von Nährstoffen, und die Kopplung zwischen den beiden herauszufinden. Der Hauptvorteil dieser hochphysiologischen Technik ist, dass der Darm in situ gelassen wird, während detaillierte Studien erlaubt werden, die in der Regel nur innerhalb von In-Vitro-Modellen durchgeführt werden. Zuerst die Ratte auf einen beheizten Operationstisch legen, einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bestätigen und eine Haut und peritoneale Exzision machen, um die Bauchhöhle freizulegen.
Bewegen Sie den Dünndarm zur Seite, um den Endbereich des Dickdarms freizulegen. Und ligate die versorgung des Dickdarms. Nach und nach extrahieren Sie den Dickdarm, beginnend aus der Endregion, und bewegen Sich in Richtung des Dünndarms, Hydratisieren des Gewebes mit isotonischer Saline, und mit Wattestäbchen, um das Bindegewebe bei Bedarf zu entfernen.
Wenn der gesamte Dickdarm entfernt wurde, legen Sie ein 15 Zentimeter großes Stück Kunststoffschläuche in das proximale Ende des kleinen Darmlumens ein und sichern Sie die Schläuche mit Nähten. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze und eine Spritzenpumpe, um den Dünndarm mit raumtemperaturisotonischer Saline bei einem Durchfluss von 25 Milliliter pro Minute vorsichtig zu spülen. Wenn das Gewebe von Chyme geleert wurde, passen Sie das Gewebe so an, dass die obere mesenterische Arterie zugänglich ist, und entfernen Sie das Bindegewebe und das Fettgewebe, um die Arterie freizulegen.
Verwenden Sie feine Point Forceps, um zwei Nähte unter die mesenterische Arterie und zwei Nähte unter der Portalvene zu platzieren. Füllen Sie einen 22-Spur-Kunststoffkatheter, der an einer Walzpumpe mit Perfusionspuffer befestigt ist, und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere ein kleines Loch in die mesenterische Arterie, wobei der Katheter sofort in den Schnitt einfügt wird. Legen Sie den Katheter innerhalb von zwei Minuten nach dem Schneiden eines Lochs in die Arterie, sonst wird der Darm wahrscheinlich von ischämischen Schäden leiden.
Sobald der Katheter mit einer Naht gesichert ist, starten Sie die Walzpumpe, um die Perfusion mit einem Durchfluss von 7,5 Milliliter pro Minute zu initiieren. Wenn die Blutgefäße in der Darm- und Portalvene blass werden, schneiden Sie ein Loch in die Portalvene. Legen Sie einen Metallkatheter ein und sichern Sie den Metallkatheter mit einer weiteren Naht.
Achten Sie beim Einsetzen des Katheters in die Portalvene, da die Vene dünn wandbein ist. Da die Wache nun jedoch durchsetzt ist, ist ein schnelles Einsetzen nicht entscheidend. Nach dem Sammeln der Perfusionsausgabe für eine Minute, messen Sie die Lautstärke und klicken Sie auf Experiment im Druckaufzeichnungsprogramm ausführen, um die Perfusionsdruckerfassungsaufzeichnungen zu initiieren.
Dann bedecken Sie den Darm mit einem befeuchteten Laborgewebe, um es vor dem Austrocknen zu bewahren, und bestätigen Sie, dass das distale Ende des Darms nicht blockiert ist, und ein luminal haploid kann verlassen. Um den Teildruck von Sauerstoff und Kohlendioxid zu messen, sammeln Sie den Perfusionspuffer durch ein Drei-Wege-Hahnenventil unmittelbar vor dem Eindringen in das Organ, nach etwa drei Minuten Perfusion, und aus dem katheter in die Portalvene eingeführten Katheter. Legen Sie die Proben auf Eis und verwenden Sie einen automatisierten Blutgasanalysator, um die Proben kurz nach der Entnahme zu messen.
Verwenden Sie einen Fraktionskollektor, um die ersten Basisstichproben zu erhalten. Nach 10 bis 15 Minuten Baseline-Sammlung verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um das erste intraarterielle Stimulans durch einen Drei-Wege-Stop-Hahn bei einem Durchfluss von 35 Millilitern pro Minute zu verabreichen. Führen Sie luminale Stimulationen durch eine erste Stimulation boas Injektion mit einem 2,5 Milliliter pro Minute Durchflussrate über die ersten fünf Minuten der Stimulation, gefolgt von der Verabreichung der Testlösung bei 5 Milliliter pro Minute Durchflussrate.
Sobald eine luminale Stimulationsperiode vorbei ist, spülen Sie das Lumen mit isotonischer Saline mit einem Durchfluss von 2,5 Milliliter pro Minute für fünf Minuten. Dann sammeln Sie Basisproben mit 5 Milliliterpro Minute für 15 bis 30 Minuten, bevor die nächste Testsubstanz verabreicht wird. Am Ende des Experiments eine geeignete, positive Kontrolle, um die Reaktionsfähigkeit der Zubereitung für fünf bis zehn Minuten zu testen, sammeln und zusätzliche 10 bis 15 Minuten Baseline-Proben am Ende der Positivkontrolle Stimulationsperiode.
Hier wird ein Beispiel für qualitativ hochwertige Daten gezeigt, die Glucagon-ähnliche Peptid-1 oder GLP-1 zeigen, Sekretion aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm, der in einem Minutentakt gesammelt wird. Unter basalen Bedingungen war die Sekretion stabil, während sowohl vor als auch nach der Verabreichung des Testreizes und der positiven Kontrolle eine robuste sekretorische Reaktion offensichtlich war. Diese GLP-1-Sekretionsdaten, die aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm gewonnen wurden, sind von schlechter Qualität mit einer unbeständigen Sekretion, die bei basalen Bedingungen gemessen wird, die während der Tests in einer Weise nach oben drifteten, die nichts mit den Verabreichungen der Prüfsubstanz oder der Positivkontrolle zu tun zu haben schien.
Es ist daher unmöglich festzustellen, ob die erhöhte GLP-1-Sekretion, die am Ende der vaskulären Fructosestimulation beobachtet wurde, eine fructose vermittelte Reaktion war. Bei diesem Versuch, die Katheter richtig zu sichern und die Perfusionsgeräte gründlich zu reinigen, da der Perfusionspuffer ein ausgezeichnetes Medium für das Bakterienwachstum bietet. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie In-Vitro-Studien an hormonsekretierenden Zelllinien primärer Darmzellkulturen durchgeführt werden, um die intrazelluläre Produktion von zyklischem AMP oder intrazellulärem Kalzium direkt zu untersuchen.
Also haben wir bereits die Methode jetzt für die Aufklärung einer Reihe von Prozessen hinter der Absorption von Nährstoffen und den Mechanismus der Sekretion der Hormone verwendet und es hat sich als äußerst nützlich erwiesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blockern oder Aktivatoren molekularer Standorte extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Labormantels, Handschuhen und einer Schutzbrille, eine Dunstabzugshaube sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens eingenommen werden.
