Il metodo che abbiamo sviluppato qui si è rivelato estremamente utile nel nostro lavoro, cercando di scoprire i meccanismi molecolari di secrezione di ormoni dall'intestino, ma anche l'assorbimento dei nutrienti, e l'accoppiamento tra i due. Il vantaggio principale di questa tecnica altamente fisiologica è che l'intestino viene lasciato in situ, consentendo allo stesso tempo studi dettagliati che di solito vengono eseguiti solo all'interno di modelli in vitro. In primo luogo mettere il topo su un tavolo operatorio riscaldato, confermare una mancanza di risposta al dito del dito e fare una pelle e un'escissione peritoneale per esporre la cavità addominale.
Spostare l'intestino tenue di lato per esporre la regione terminale del colon. E ligate la vascucolatura di rifornimento al colon. Estrarre gradualmente il colon, partendo dalla regione terminale, e spostandosi verso l'intestino tenue, idratando il tessuto con soluzione salina isotonica e usando tamponi di cotone per rimuovere il tessuto connettivo se necessario.
Quando tutto il colon è stato rimosso, inserire un pezzo di tubi di plastica di 15 centimetri nell'estremità prossimale del piccolo lume intestinale e fissare i tubi con suture. Quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri e una pompa per siringhe per sciacquare con cura l'intestino tenue con soluzione salina isotonica a temperatura ambiente a una portata di 25 millilitri al minuto. Quando il tessuto è stato svuotato di chimo, regolare i tessuti in modo che l'arteria mesenterica superiore sia accessibile e rimuovere il tessuto connettivo e il tessuto adiposo per esporre l'arteria.
Utilizzare le forcep a punto fine per posizionare due suture sotto l'arteria mesenterica e due suture sotto la vena portale. Riempire un catetere di plastica calibro 22 collegato a una pompa di rotolamento con tampone perfusione e utilizzare un paio di forbici chirurgiche per tagliare un piccolo foro nell'arteria mesenterica, inserendo immediatamente il catetere nell'incisione. Inserire il catetere entro due minuti dal taglio di un foro nell'arteria, altrimenti l'intestino soffrirà probabilmente di danni ischemici.
Non appena il catetere è stato fissato con una sutura, avviare la pompa di laminazione per avviare la perfusione a una portata di 7,5 millilitri al minuto. Quando i vasi sanguigni nell'intestino e nella vena del portale diventano pallidi, tagliare un buco nella vena del portale. Inserire un catetere metallico e fissare il catetere metallico con un'altra sutura.
Fare attenzione quando si inserisce il catetere nella vena porta, poiché la vena è sottile murata. Tuttavia, poiché la guardia viene ora perfusa, l'inserimento rapido non è cruciale. Dopo aver raccolto l'uscita di perfusione per un minuto, misurare il volume e fare clic sull'esperimento di esecuzione nel programma di registrazione della pressione per avviare le registrazioni di acquisizione della pressione di perfusione.
Quindi coprire l'intestino con un tessuto da laboratorio inumidito per evitare che si asciughi e confermare che l'estremità distale dell'intestino non è bloccata e un aploide luminare può uscire. Per misurare la pressione parziale di ossigeno e anidride carbonica, raccogliere il tampone perfusione attraverso una valvola a tre vie del gallo di arresto immediatamente prima che entri nell'organo, dopo circa tre minuti di perfusione, e dal catetere inserito nella vena del portale. Posizionare i campioni sul ghiaccio e utilizzare un analizzatore automatico di gas nel sangue per misurare i campioni subito dopo la raccolta.
Utilizzate un raccoglitore di frazioni per ottenere i primi campioni di base. Dopo 10-15 minuti di raccolta del basale, utilizzare una pompa per siringhe per somministrare il primo stimolante di prova intraarteriale attraverso un stop-cock a tre way a una portata di 35 millilitri al minuto. Eseguire stimolazioni luminali mediante un'iniezione iniziale di boas di stimolazione erogata a una portata di 2,5 millilitri al minuto nei primi cinque minuti della stimolazione, seguita dalla somministrazione della soluzione di prova a una portata di 5 millilitri al minuto.
Non appena un periodo di stimolazione luminare è finito, sciacquare il lume con soluzione salina isotonica a una portata di 2,5 millilitri al minuto per cinque minuti. Quindi raccogliere campioni di base a 5 millilitri al minuto per 15-30 minuti prima che la sostanza in esame successiva sia somministrata. Al termine dell'esperimento, somministrare un controllo adeguato e positivo per verificare la reattività della preparazione per cinque-10 minuti, raccogliendo e altri 10-15 minuti di campioni di base al termine del periodo di stimolazione del controllo positivo.
Ecco un esempio di dati di buona qualità, che dimostrano peptide-1 o GLP-1 simile al glucagone, secrezione da un intestino tenue perfuso di ratto isolato raccolto a intervalli di un minuto. In condizioni basali, la secrezione era costante mentre sia prima che dopo la somministrazione dello stimolo del test e del controllo positivo, era evidente una robusta risposta secretoria. Questi dati di secrezione GLP-1 ottenuti da un intestino tenue perfuso di ratto isolato sono di scarsa qualità con una secrezione instabile misurata in condizioni basali che si è allontanata verso l'alto durante la prova in un modo che sembrava non correlato alle amministrazioni della sostanza in esame o al controllo positivo.
È quindi impossibile concludere se l'aumento della secrezione di GLP-1 osservato alla fine della stimolazione vascolare del fruttosio fosse una risposta mediata dal fruttosio. Durante il tentativo di questa procedura per proteggere correttamente i cateteri e pulire accuratamente l'apparecchiatura perfusione in quanto il tampone perfusione fornisce un mezzo eccellente per la crescita batterica. Seguendo questa procedura, altri metodi come studi in vitro su linee cellulari che secernono ormoni di colture cellulari intestinali primarie, possono essere eseguiti per indagare direttamente la produzione intracellulare di AMP ciclico o calcio intracellulare.
Quindi abbiamo già usato il metodo ora per la spiegazione di una serie di processi dietro l'assorbimento dei nutrienti e il meccanismo di secrezione degli ormoni e si è rivelato estremamente utile. Non dimenticare che lavorare con bloccanti o attivatori di siti molecolari può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza, una cappa aspirante dovrebbe sempre essere presa durante l'esecuzione di questa procedura.
