O método que desenvolvemos aqui acabou sendo extremamente útil em nosso trabalho, tentando descobrir os mecanismos moleculares de secreção de hormônios do intestino, mas também a absorção de nutrientes, e o acoplamento entre os dois. A principal vantagem dessa técnica altamente fisiológica é que o intestino é deixado in situ, ao mesmo tempo em que permite estudos detalhados que geralmente só são realizados dentro de modelos In Vitro. Primeiro coloque o rato em uma mesa de operação aquecida, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, e faça uma excisão de pele e peritoneal para expor a cavidade abdominal.
Mova o intestino delgado para o lado para expor a região terminal do cólon. E ligadurar a vasculatura de fornecimento para o cólon. Extraia gradualmente o cólon, começando da região terminal, e movendo-se em direção ao intestino delgado, hidratando o tecido com soro fisiológico isotônico, e usando cotonetes de algodão para remover o tecido conjuntivo conforme necessário.
Quando todo o cólon tiver sido removido, insira um pedaço de tubo plástico de 15 centímetros na extremidade proximal do pequeno lúmen intestinal, e fixe o tubo com suturas. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros e uma bomba de seringa para lavar cuidadosamente o intestino delgado com soro fisiológico isotônico de temperatura ambiente a uma taxa de fluxo de 25 mililitros por minuto. Quando o tecido tiver sido esvaziado de chyme, ajuste os tecidos para que a artéria mesentérica superior seja acessível e remova o tecido conjuntivo e o tecido adiposo para expor a artéria.
Use fórceps de ponta fina para colocar duas suturas sob a artéria mesentérica e duas suturas sob a veia portal. Encha um cateter plástico de calibre 22 preso a uma bomba de rolamento com tampão de perfusão e use um par de tesouras cirúrgicas para cortar um pequeno orifício na artéria mesentérico, inserindo imediatamente o cateter na incisão. Insira o cateter dentro de dois minutos após cortar um buraco na artéria, caso contrário, o intestino provavelmente sofrerá danos isquêmicos.
Assim que o cateter estiver protegido com uma sutura, inicie a bomba de rolamento para iniciar a perfusão a uma taxa de fluxo de 7,5 mililitros por minuto. Quando os vasos sanguíneos no intestino e a veia portal ficarem pálidos, corte um buraco na veia portal. Insira um cateter metálico e fixe o cateter metálico com outra sutura.
Tome cuidado ao inserir o cateter na veia portal, pois a veia está fina. No entanto, como o guarda está sendo perfundido, a inserção rápida não é crucial. Depois de coletar a saída de perfusão por um minuto, meça o volume e clique em executar o experimento no programa de gravação de pressão para iniciar as gravações de aquisição de pressão de perfusão.
Em seguida, cubra o intestino com um tecido de laboratório umedecido para evitar que ele seque, e confirme que a extremidade distal do intestino não está bloqueada, e um haploide luminal pode sair. Para medir a pressão parcial de oxigênio e dióxido de carbono, colete o tampão de perfusão através de uma válvula de stop-cock de três vias imediatamente antes de entrar no órgão, após aproximadamente três minutos de perfusão, e do cateter inserido na veia portal. Coloque as amostras no gelo e use um analisador automatizado de gás de sangue para medir as amostras logo após a coleta.
Use um coletor de frações para obter as primeiras amostras de linha de base. Após 10 a 15 minutos de coleta de linha de base, use uma bomba de seringa para administrar o primeiro estimulante de teste intraarterial através de um stop-cock de três vias a uma taxa de fluxo de 35 mililitros por minuto. Realize estimulações luminais por uma injeção inicial de estimulação bem entregue a uma taxa de fluxo de 2,5 mililitros por minuto durante os primeiros cinco minutos da estimulação, seguida pela administração da solução de teste a 5 mililitros por minuto de fluxo.
Assim que um período de estimulação luminal acabar, lave o lúmen com soro fisiológico isotônico a uma taxa de fluxo de 2,5 mililitros por minuto durante cinco minutos. Em seguida, colete amostras de linha de base a 5 mililitros por minuto durante 15 a 30 minutos antes que a próxima substância teste seja administrada. Ao final do experimento, administre um controle positivo e adequado para testar a capacidade de resposta da preparação por cinco a 10 minutos, coletando e adicionais de 10 a 15 minutos de amostras de linha de base no final do período positivo de estimulação do controle.
Aqui é mostrado um exemplo de dados de boa qualidade, demonstrando peptídeo-1 ou GLP-1 semelhante a Glucagon, secreção de um intestino delgado de rato perfusado isolado coletado em intervalos de um minuto. Em condições basais, a secreção foi constante enquanto antes e depois da administração do estímulo do teste e do controle positivo, uma resposta secreta robusta era evidente. Estes dados de secreção GLP-1 obtidos de um intestino delgado de rato perfusado isolado são de má qualidade com uma secreção instável medida em condições basais que se deslocavam para cima durante todo o teste de uma maneira que parecia não estar relacionada às administrações de substâncias de teste ou ao controle positivo.
Portanto, é impossível concluir se o aumento da secreção de GLP-1 observada no final da estimulação da frutose vascular foi uma resposta mediada por frutose. Ao tentar este procedimento para cuidar adequadamente dos cateteres e limpar completamente o equipamento de perfusão, pois o tampão de perfusão fornece um excelente meio de crescimento bacteriano. Após este procedimento, outros métodos como estudos in vitro sobre linhas celulares secretantes de hormônios de culturas primárias de células intestinais, podem ser realizados para investigar diretamente a produção intracelular de AMP cíclico ou cálcio intracelular.
Então já usamos o método agora para elucidação de uma série de processos por trás da absorção de nutrientes e o mecanismo de secreção dos hormônios e acabou sendo extremamente útil. Não se esqueça que trabalhar com bloqueadores ou ativadores de locais moleculares pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de um jaleco, luvas e óculos de segurança, um capuz de fumaça deve ser sempre tomado durante a realização deste procedimento.
