La méthode que nous avons développée ici s’est avéré extrêmement utile dans nos travaux, en essayant de découvrir les mécanismes moléculaires de sécrétion d’hormones de l’intestin, mais aussi l’absorption des nutriments, et le couplage entre les deux. Le principal avantage de cette technique hautement physiologique est que l’intestin est laissé in situ, tout en permettant des études détaillées qui ne sont généralement effectuées que dans les modèles in vitro. Placez d’abord le rat sur une table d’opération chauffée, confirmez un manque de réponse au pincement d’onde, et faites une excision de peau et péritonéale pour exposer la cavité abdominale.
Déplacez l’intestin grêle sur le côté pour exposer la région terminale du côlon. Et ligate la vascularisation d’approvisionnement au côlon. Extraire graduellement le côlon, à partir de la région terminale, et se déplacer vers l’intestin grêle, hydrater le tissu avec salin isotonique, et en utilisant des cotons-tiges pour enlever le tissu conjonctif si nécessaire.
Lorsque tout le côlon a été enlevé, insérez un morceau de 15 centimètres de tube en plastique dans l’extrémité proximale du petit lumen intestinal, et fixez le tube avec des sutures. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres et une pompe à seringues pour rincer soigneusement l’intestin grêle avec une solution saline isotonique à température ambiante à un débit de 25 millilitres par minute. Lorsque le tissu a été vidé de chyme, ajuster les tissus de sorte que l’artère mésentérique supérieure est accessible et enlever le tissu conjonctif et le tissu adipeux pour exposer l’artère.
Utilisez des forceps à points fins pour placer deux sutures sous l’artère mésentérique et deux sutures sous la veine du portail. Remplissez un cathéter en plastique de calibre 22 attaché à une pompe à roulement avec tampon de perfusion et utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper un petit trou dans l’artère mésentérique, insérant immédiatement le cathéter dans l’incision. Insérez le cathéter dans les deux minutes suivant la coupe d’un trou dans l’artère, sinon l’intestin souffrira probablement de dommages ischémiques.
Dès que le cathéter a été fixé à l’aide d’une suture, démarrez la pompe à rouler pour lancer la perfusion à un débit de 7,5 millilitres par minute. Lorsque les vaisseaux sanguins de l’intestin et de la veine du portail pâlissent, coupez un trou dans la veine du portail. Insérez un cathéter métallique et fixez le cathéter métallique avec une autre suture.
Prenez soin lors de l’insertion du cathéter dans la veine du portail, car la veine est mince murée. Cependant, comme le garde est maintenant perfusé, l’insertion rapide n’est pas cruciale. Après avoir recueilli la sortie de perfusion pendant une minute, mesurez le volume et cliquez sur exécuter l’expérience dans le programme d’enregistrement de pression pour lancer les enregistrements d’acquisition de pression de perfusion.
Couvrez ensuite l’intestin d’un tissu de laboratoire humidifié pour l’empêcher de sécher, et confirmez que l’extrémité distale de l’intestin n’est pas bloquée, et qu’un haploïde luminal peut sortir. Pour mesurer la pression partielle de l’oxygène et du dioxyde de carbone, recueillir le tampon de perfusion à travers une valve à trois sens stop-coq immédiatement avant qu’il n’entre dans l’organe, après environ trois minutes de perfusion, et à partir du cathéter inséré dans la veine portail. Placez les échantillons sur la glace et utilisez un analyseur automatisé de gaz sanguin pour mesurer les échantillons peu après la collecte.
Utilisez un collecteur de fractions pour obtenir les premiers échantillons de base. Après 10 à 15 minutes de collecte de base, utilisez une pompe à seringues pour administrer le premier stimulant d’essai intraartérial par un stop-cock à trois sens à un débit de 35 millilitres par minute. Effectuez des stimulations luminaires par une injection initiale de boas de stimulation administrée à un débit de 2,5 millilitres par minute au cours des cinq premières minutes de la stimulation, suivie de l’administration de la solution d’essai à un débit de 5 millilitres par minute.
Dès qu’une période de stimulation luminale est terminée, rincer le lumen avec de la solution saline isotonique à un débit de 2,5 millilitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, prélevez des échantillons de base à 5 millilitres par minute pendant 15 à 30 minutes avant l’administration de la substance d’essai suivante. À la fin de l’expérience, administrer un contrôle approprié et positif pour vérifier la réactivité de la préparation pendant cinq à dix minutes, la collecte et 10 à 15 minutes supplémentaires d’échantillons de base à la fin de la période de stimulation positive.
Voici un exemple de données de bonne qualité, démontrant glucagon-like peptide-1 ou GLP-1, sécrétion d’un intestin grêle perfusé isolé de rat recueilli à intervalles d’une minute. Dans des conditions basales, la sécrétion était stable tandis qu’avant et après l’administration du stimulus d’essai et du contrôle positif, une réponse sécrétaire robuste était évidente. Ces données de sécrétion de GLP-1 obtenues à partir d’un intestin grêle perfusé isolé de rat sont de mauvaise qualité avec une sécrétion instable mesurée à des conditions basales qui ont dérivé vers le haut tout au long de l’essai d’une manière qui semblait n’avoir aucun rapport avec les administrations de substance d’essai ou au contrôle positif.
Il est donc impossible de conclure si la sécrétion accrue de GLP-1 observée à la fin de la stimulation vasculaire de fructose était une réponse médiatisée de fructose. Tout en essayant cette procédure de soins pour fixer les cathéters correctement et de nettoyer soigneusement l’équipement de perfusion que le tampon de perfusion fournit un excellent moyen pour la croissance bactérienne. Après cette procédure, d’autres méthodes comme les études in vitro sur les lignées cellulaires sécrétant des hormones des cultures cellulaires intestinales primaires, peuvent être effectuées pour étudier directement la production intracellulaire d’AMP cyclique ou de calcium intracellulaire.
Nous avons donc déjà utilisé la méthode maintenant pour l’élucidation d’un certain nombre de processus derrière l’absorption des nutriments et le mécanisme de sécrétion des hormones et il s’est avéré être extrêmement utile. N’oubliez pas que travailler avec des bloqueurs ou des activateurs de sites moléculaires peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que l’utilisation d’un manteau de laboratoire, gants et lunettes de sécurité, une hotte de fumée doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.
