Dies ist ein Protokoll, das untersucht, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht und wie er diese Materialien im Raum verteilt. Es ist ein ergänzendes Werkzeug in unserer Studie der Darmmechanosensitivität. Die Hauptvorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es verwendet werden kann, um Materialien oder Mischungen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften zu untersuchen, und dass die Auflösung es uns ermöglicht, regionale Transite über kurze Darmsegmente aufzulösen.
Diese Technik trägt zu unserem Verständnis der Darmmechanosensitivität bei. Es hilft uns zu verstehen, wie der Dünndarm Transitentscheidungen trifft, basierend auf den mechanischen Hinweisen, die er von den intraluminalen Inhalten erhält. Um zu beginnen, bereiten Sie die Sonde vor, indem Sie ein Zuführrohr von 18 Gauge Dicke und 50 Millimeter Länge an eine 1-Milliliter-Spritze anbringen und 200 Mikroliter RITC-Lösung oder Mikrokugellösung ziehen.
Als nächstes halten Sie das nüchterne Tier manuell mit der einhändigen Rückhaltetechnik zurück und führen Sie dann die Ernährungssonde vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre der Maus ein, bis sie in den Magen gelangt. Nach dem Einführen den Spritzeninhalt langsam in den Magen ausstoßen und den Schlauch vorsichtig von der Maus entfernen. Nach dem Gavage, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.
Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das In-vivo-Bildgebungsinstrument ein, damit es die gewünschte Temperatur erreicht. Stellen Sie die Maus nach der Euthanasie in Rückenlage auf ein Sezierstadium und stecken Sie ihre vier Anhängsel auf die Bühne, um Zugang zum Bauch zu erhalten. Als nächstes befeuchten Sie die Oberfläche des Bauches mit 70% Ethanol.
Als nächstes verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um die Haut zu ziehen und einen Querschnitt mit einer scharfen chirurgischen Schere 1 Zentimeter über dem Anus zu machen. Um die intraperitoneale Höhle freizulegen, setzen Sie den Schnitt vertikal den Bauch hinauf bis zum Brustkorb fort. Behandeln Sie den Darm sanft und schätzen Sie seine Orientierung in der Bauchhöhle, bevor Sie ihn manipulieren.
Schneiden Sie die proximale zur gastroösophagealen Verbindung, trennen Sie so den Magen von der Speiseröhre und entwirren Sie sanft den Dickdarm, den Blinddarm und den Dünndarm, indem Sie langsam in die entgegengesetzte Richtung ziehen. Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um die Anhänge des Mesenteriums vom Darm zu trennen. Übertragen Sie später mit der Pinzette den sezierten Darm auf das Messblatt.
Legen Sie den Magen auf 0 Millimeter und ordnen Sie den Darm entlang des Lineals bis 200 Millimeter an, schneiden Sie dann den Darm bei 200 Millimetern mit einer Mikrodissektionsschere und wiederholen Sie diesen Vorgang der Darmausrichtung. Sobald das Gewebe auf dem Lineal angeordnet ist, ordnen Sie den Blinddarm parallel zum Gewebe an, aber nicht in direktem Kontakt mit ihm. Legen Sie das Messblatt mit dem sezierten Gewebe in einen dunklen Bereich, damit die Fluoreszenz erhalten bleibt, bis es Zeit für die Aufnahme ist.
Um die Ex-vivo-Bildgebung zu starten, öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Melden Sie sich an und initialisieren Sie das bildgebende Gerät, um für die Bildaufnahme bereit zu sein. Stellen Sie für RITC Gavage die Anregung auf 535 Nanometer und die Emissionen auf 600 Nanometer ein.
Stellen Sie für grüne Mikrokugelperlen die Anregung auf 465 Nanometer und die Emission auf 520 Nanometer ein. Stellen Sie nun die Belichtung auf Auto und wählen Sie das Sichtfeld aus. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich der Darm während des Transports nicht verschoben hat, legen Sie das Messblatt innerhalb des Sichtfeldes in das Instrument.
Schließen Sie die Tür zum Instrument sicher und wählen Sie Schnappschuss, um das Sichtfeld zu fotografieren. Speichern Sie die gesammelten Bilder zur Analyse auf einem Flash-Laufwerk. Als nächstes speichern Sie einzelne Aufnahmen der fluoreszierenden und fotografischen Bilder.
Eine Überlagerung des Fotos und der Fluoreszenz zeigt die Lage von fluoreszierenden Materialien im Magen-Darm-Trakt an. Öffnen Sie die fluoreszierenden und fotografischen Bilddateien in der Bildbearbeitungssoftware zur Analyse. Passen Sie die Pixelgröße beider Bilder an, um die genauen Abmessungen zu erhalten, und schließen Sie die Fotodatei.
Verwenden Sie für das fluoreszierende Bild ein Radiergummi, um den Hintergrund zu entfernen und transparent zu machen. Erstellen Sie einen neuen Layer. Wählen Sie eine schwarze Füllung für die Ebene und ziehen Sie die Ebene so, dass sie unter der Ebene mit dem fluoreszierenden Bild liegt, und erstellen Sie einen vollständig schwarzen Hintergrund.
Speichern Sie das neue fluoreszierende Bild, das nur das fluoreszierende Signal auf schwarzem Hintergrund enthält, als neue TIF-Datei. Öffnen Sie die neuen fluoreszierenden und fotografieren Sie Bilder in ImageJ. Verwandeln Sie jedes Bild in ein 30-Bit-Bild, indem Sie Bild wählen, gefolgt von Typ und 30-Bit.
Erstellen Sie ein zusammengeführtes Bild von beiden, indem Sie Bild und anschließend Farb- und Verschmelzungskanäle auswählen. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Dialogfeld die Fotodatei für den Graukanal und die Fluoreszenzdatei unter beliebigen farbigen Kanälen aus. Deaktivieren Sie die Skalierung des zusammengeführten Bildes, indem Sie Analysieren auswählen, gefolgt von Maßstab festlegen und Zum Entfernen der Skalierung klicken.
Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug in ImageJ aus. Zeichnen Sie ein Rechteck um einen Abschnitt des Dünndarms und achten Sie dabei genau auf die Breite dieser Region von Interesse, da sie zwischen allen interessierenden Regionen konstant bleiben sollte. Duplizieren Sie den gewünschten Bereich, indem Sie Bild auswählen, gefolgt von Duplizieren und nur den Kanal auswählen, der dem farbigen Kanal entspricht.
Verwenden Sie erneut das Rechteck-Werkzeug, um einen Bereich von Interesse über das gesamte neue Bild zu zeichnen und ein Fluoreszenzprofil abzurufen, indem Sie Analysieren und anschließend Plotprofil auswählen. Öffnen Sie die Liste der Werte und kopieren Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware. Wiederholen Sie die Schritte vom Zeichnen des interessierenden Bereichs bis zum Abrufen eines Fluoreszenzprofils für jeden Abschnitt des Dünndarms, wie zuvor in einer anderen Linealreihe beschrieben.
Multiplizieren Sie in der Tabellenkalkulationssoftware jeden durchschnittlichen Intensitätswert mit der konstanten Breite des im vorherigen Schritt erstellten Rechtecks für den interessierenden Bereich. Dies ergibt den tatsächlichen Intensitätswert entlang des Dünndarms an jedem Punkt. Hier sind die durchschnittlichen Fluoreszenzspuren entlang der Länge des Dünndarms dargestellt.
Die Verteilung von fluoreszierendem Material variiert je nach Materialeigenschaften der intraluminalen Inhalte. Die Erhöhung der Anzahl der Bins, die zum Sortieren derselben Rohdatensätze verwendet werden, zeigt granulare Trace-Features, die mit weniger Bins nicht aufgelöst werden können. Kleinere Bins verringern die Messunsicherheit, erhöhen die räumliche Auflösung und spiegeln die distributive Komponente der Dünndarmmotilität besser wider.
Das geometrische Zentrum kann die räumliche Verteilung der intraluminalen Inhalte nicht vollständig charakterisieren. Diese Einschränkung der geometrischen Mittenmessung zeigt sich im Vergleich zwischen Flüssigkeiten und größeren Perlen. Die fluoreszierende Spur der größeren Perlen ist stärker verteilt, aber sie mittelt sich auf einen ähnlichen Punkt wie die der Flüssigkeit, unabhängig von der Binning-Granularität, was die Einschränkung der ausschließlichen Fokussierung auf das geometrische Zentrum unterstreicht.
Um die distributive Natur von Dünndarmkontraktionen zu berücksichtigen, wurde eine Leistungsspektralanalyse in die vorliegende Studie aufgenommen. Die Darstellung des Leistungsspektrums zeigt, dass wir bei schrumpfenden Bin-Größen signifikant dominante Frequenzen im größeren Perlenspektrum beobachten können, aber nicht in dem der kleinen Perlen. Einige, aber nicht alle dieser zusätzlichen dominanten Frequenzen sind im Flüssigkeitsspektrum vorhanden.
Die heikelsten Schritte dieses Protokolls sind die Sonde und die Dissektion. Diese sollten von den Experimentatoren standardisiert werden, bevor diese Technik zu Versuchszwecken durchgeführt wird. Dies ist ein terminales Experiment, da das Tier geopfert werden muss.
Wenn möglich, maximieren Sie die Verwendung Ihres Tiermodells, indem Sie vor diesem andere nicht-terminale Experimente durchführen. Unsere Gruppe hat diese Technik kürzlich verwendet, um unsere Entdeckung von Darm-Touch-Sets zu unterstützen, bei denen der Darm epitheliale Mechanorezeptoren verwendet, um feinere physikalische Eigenschaften zu erfassen, ähnlich wie unsere Finger.
