우리가 여기에서 개발한 방법은 창자에서 호르몬의 분비의 분자 기계장치를 찾아내기 위하여 노력하면서, 우리의 일에 있는 극단적으로 유용하다는 것을 밝혀졌습니다, 또한 양분의 흡수, 그리고 둘 사이 커플링. 이 매우 생리적인 기술의 주요 장점은 창 자가 시투에 남아 있다는 것입니다., 일반적으로 단지 생체 외 모델 내에서 수행 되는 상세한 연구를 허용 하는 동안. 먼저 가열 된 수술대에 쥐를 배치, 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 복강을 노출피부와 복막 절개를합니다.
소장을 측면으로 이동하여 결장의 단말 영역을 노출시합니다. 그리고 결장에 공급 혈관을 리게이트. 점차적으로 결장추출, 말단 부위에서 시작하여 소장쪽으로 이동하여, 이소토닉 식염수로 조직을 수화하고, 필요에 따라 결합 조직을 제거하기 위해 면봉을 사용한다.
모든 결장이 제거되면 15센티미터 의 플라스틱 튜브 조각을 소장 루멘의 근동 끝에 삽입하고 봉합사로 튜브를 고정하십시오. 그런 다음 10밀리리터 주사기와 주사기 펌프를 사용하여 미세한 온도 동소식 식염수로 소장을 분당 유량 25밀리리터로 조심스럽게 플러시합니다. 조직이 chyme의 비워졌을 때, 상부 장간 동맥이 접근 할 수 있도록 조직을 조정하고 동맥을 노출하기 위해 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다.
미세 한 점 집게를 사용하여 막술 동맥 아래에 두 개의 봉합사와 포털 정맥 아래에 두 봉합사를 배치하십시오. 관류 완충액으로 롤링 펌프에 부착된 플라스틱 22 게이지 카테터를 채우고 한 쌍의 수술 가위를 사용하여 장간 동맥의 작은 구멍을 자르고 즉시 카테터를 절개에 삽입합니다. 동맥에 구멍을 절단 2 분 이내에 카테터를 삽입, 그렇지 않으면 창자는 가능성이 허혈성 손상으로 고통받을 것이다.
카테터가 봉합사로 고정되자마자 롤링 펌프를 시작하여 분당 7.5 밀리리터의 유량으로 관류를 시작합니다. 창자 및 포탈 정맥의 혈관이 창백해지면 포털 정맥에 구멍을 뚫습니다. 금속 카테터를 삽입하고 다른 봉합사로 금속 카테터를 고정합니다.
정맥이 얇은 벽으로 바변하기 때문에 카테터를 포털 정맥에 삽입할 때 주의하십시오. 그러나 가드가 현재 침투되고 있기 때문에 빠른 삽입은 중요하지 않습니다. 1분 동안 관류 출력을 수집한 후 압력 기록 프로그램에서 볼륨을 측정하고 실험을 클릭하여 관류 압력 획득 기록을 시작합니다.
그런 다음 축축한 실험실 조직으로 내장을 덮고 건조를 막고 장의 말단이 막히지 않고 발광 하플로이드가 빠져나갈 수 있는지 확인합니다. 산소와 이산화탄소의 부분 압력을 측정하기 위해, 관류의 약 3 분 후, 그리고 포털 정맥에 삽입 카테터에서 장기에 들어가기 직전에 3 방향 스톱 콕 밸브를 통해 관류 버퍼를 수집합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 자동 혈액 가스 분석기를 사용하여 수집 직후 샘플을 측정합니다.
분수 수집기를 사용하여 첫 번째 기준선 샘플을 가져옵니다. 기준선 수집 10~15분 후, 주사기 펌프를 사용하여 분당 35밀리리터의 3방향 스톱콕을 통해 첫 번째 내동맥 내 테스트 자극제를 투여합니다. 자극의 처음 5분 동안 분당 2.5 밀리리터 의 유량으로 전달된 초기 자극 보아사에 의해 발광 자극을 수행하고, 이어서 분당 5 밀리리터의 시험 용액을 분당 유량으로 투여한다.
발광 자극 기간이 지나자마자, 5분 동안 분당 2.5 밀리리터의 유량으로 동위 상색식염으로 루멘을 플러시하십시오. 그런 다음 다음 시험 물질이 투여되기 전에 분당 5 밀리리터에서 기준선 샘플을 15~30분 동안 수집합니다. 실험의 끝에서, 양성 제어 자극 기간의 끝에 베이스 라인 샘플의 추가 10 ~ 15 분, 수집 및 추가 10 10 분 동안 준비의 응답성을 테스트하기 위해 적합한 긍정적 인 제어를 관리한다.
여기에 글루카곤과 같은 펩티드-1 또는 GLP-1, 1분 간격으로 수집된 고립된 퍼퓨즈 쥐의 분비등을 보여주는 양질의 데이터의 예를 나타낸다. 기저 조건하에서, 분비는 시험 자극과 긍정적인 통제의 전후 둘 다 동안 안정되었습니다, 강력한 분비 반응은 분명했습니다. 이러한 GLP-1 분비 데이터는 극한의 개구부 쥐에서 얻은 이러한 분비 데이터는 시험 약물 투여 또는 양성 대조군과 관련이 없는 것으로 보이는 방식으로 시험 전반에 걸쳐 위쪽으로 표류하는 기저 조건에서 측정된 불안정한 분비로 품질이 좋지 않다.
따라서 혈관 과당 자극의 끝에서 관찰된 증가된 GLP-1 분비액이 과당 중재 반응인지 여부를 결론짓는 것은 불가능합니다. 관류 완충액이 세균 성장을 위한 우수한 매체를 제공하기 때문에 카테터를 제대로 보호하고 관류 장비를 철저히 청소하는 이 절차를 시도하면서. 이 절차에 따라, 1 차장 세포 배양의 호르몬 분비 세포주에 대한 생체외 연구와 같은 다른 방법은 순환 AMP 또는 세포 내 칼슘의 세포 내 생산을 직접 조사하기 위해 수행 될 수 있습니다.
그래서 우리는 이미 영양소의 흡수와 호르몬의 분비 메커니즘 뒤에 프로세스의 수의 elucation에 대 한 지금 방법을 사용 하 고 그것은 매우 유용한 것으로 밝혀졌다. 분자 부위의 차단제 나 활성화기와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 실험실 코트, 장갑 및 안전 안경을 사용하는 것과 같은 예방 조치는이 절차를 수행하는 동안 항상 연기 후드를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
