Der Hauptvorteil unserer neuartigen Technik, die wir E plus E, die für Anreicherung plus Expansion steht, nannte, ist also, dass wir diese Zellen, seltene antigenspezifische Zellen, gleichzeitig anreichern und erweitern können. Dies ermöglicht es uns, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu entwickeln, die wir verwenden werden, um ihre Rolle in verschiedenen Umgebungen und in verschiedenen klinischen Umgebungen zu untersuchen, oder uns sogar erlaubt, jetzt eine große Anzahl von Zellen zu entwickeln, die wir für die Immuntherapie in einer Weise nutzen können, die wir vorher nicht konnten. Die von uns entwickelte Methode, dieses E plus E, kann helfen, wichtige Fragen in der Grundimmunologie über das Vorhandensein von Neoepitopen zu beantworten.
Was sind Neoepitope? Das sind die personalisierten Epitope, von denen wir wissen, dass sie jetzt sehr wichtig für die Krebsimmuntherapie und auch die antigenspezifische Dynamik sind und wie diese Faktoren Krankheitszustände und eine effektive Zelltherapie beeinflussen. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Immuntherapie, da die künstliche Antigen-präsentierende Zelle des Nanopartikels ein standardisierbares Produkt sein könnte, das leicht auf die Immunantworten des einzelnen Patienten zugeschnitten werden kann.
Um künstliche Antigen-präsentierende Nanopartikelzellen zu erzeugen, setzen Sie die lyophilisierten Partikel in einem Milliliter Resuspensionspuffer wieder auf und wirbeln die Suspension mindestens 15 Minuten lang kräftig aus, bis keine Aggregate sichtbar sind. Partikel, die vor der Reaktion mit Protein nicht ausreichend gewirbelt und resuspendiert wurden, führen zu größeren aggregierten Partikeln, die nicht dissoziiert werden können. Legen Sie die magnetischen Partikel auf einen magnetischen Ständer, um den Überstand zu entfernen und sie mit 0,5 Millilitern frischer Resuspensionspuffer wieder aufzusetzen.
Übertragen Sie die Partikelsuspension auf eine Glasszintillationsdurchstechflasche für Wirbel, bis keine Aggregate sichtbar sind, und fügen Sie 0,1 Milligramm an gesamten Stimulierenden Signalen pro einem Milligramm Resuspendierten partikel hinzu. Nach dem Wirbeln die Suspension 2,5 Stunden bei Raumtemperatur mit Einem Mischen in einem Rotator reagieren lassen, gefolgt von der Zugabe von 0,1 MilliliterLöschpuffer für eine zusätzliche 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit Mischen. Am Ende der zweiten Reaktion die Szintillationsflasche auf den magnetischen Ständer legen und die Partikel viermal in einem Milliliter Resuspensionspuffer waschen, den Puffer entfernen, wenn er sich nach jeder Wäsche frei dreht, und ihn durch einen frischen Resuspensionspuffer für die anschließende Wäsche auf dem Magneten ersetzen.
Nach der letzten Wäsche die Lösung ansaugen und die Partikel aus dem magnetischen Ständer entfernen, dann die Partikel in einem Milliliter frischer Resuspensionspuffer bei vier Grad Celsius für bis zu sechs Monate lagern. Um antigenspezifische CD8+T-Zellen zu isolieren, mazerieren Sie die Milz und Lymphknoten von wilden Typ C57 schwarzen 6J-Mäusen durch ein steriles, 70-Mikrometer-Zellsieb mit häufigen PBS-Spülungen und verwenden Sie ein No-Touch-CD8+T-Zellisolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Nicht-CD8+T-Zellen zu beseitigen. Nach dem Zählen die isolierten CD8+T-Zellen durch Zentrifugation zu sammeln und das Pellet in 100 Mikroliter PBS, ergänzt mit 0,5%Bovine Serum Albumin und zweiMillimolar EDTA, wieder aufzusetzen, dann die Zellen mit den nanopartikeln künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen so inkubieren, dass es ein mal 10 bis 10 bis 10 , Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr für eine Stunde bei vier Grad Celsius mit kontinuierlicher Mischung.
Waschen Sie am Ende der Inkubation die Nanopartikelzellsuspension dreimal auf dem magnetischen Ständer, wie gezeigt, und setzen Sie die künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen und die angereicherten CD8+T-Zellen in 500 Mikroliter n frischem, ergänztem Medium mit 1%T Zellwachstumsfaktor nach der letzten Wäsche wieder auf. Für eine maximale Zellrückgewinnung ist es wichtig, die Partikel und Zellen für mindestens zwei Minuten auf der Magnetsäule zu belassen und den Puffer sorgfältig zu saugen, ohne die Partikel und Zellen, die dem Magnetfeld unterliegen, zu stören. Nach zählungsmäßigem Saatgut 2,5 mal 10 bis fünf angereicherte CD8+T-Zellen und magnetische Partikelmischung pro 160 Mikroliter ergänztes Medium plus 1%TCGF in einer 96-well U-Bodenplatte.
Füttern Sie am dritten Tag die Zellen mit 80 Mikrolitern ergänzten Mediums mit 2%T Zellwachstumsfaktor pro Brunnen und geben Sie die Platte für vier weitere Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am siebten Tag ernten Sie die stimulierten Zellen zum Zählen in ein fünf Milliliter Runderrohr und sammeln die Zellen per Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in 0,5 Milliliter PBS wieder auf, ergänzt mit 0,05% Natriumazid und 2%fetalem Rinderserum zum Zählen und aliquotieren fünfmal 10 bis fünf mal 10 bis fünf mal 10 zu den fünften Zellen in neue Fünf-Milliliter-Rundbodenröhren für antigenspezifische Färbung.
Die entsprechenden Rohre mit biotinyliertem MHC-ig und Anti-Maus-CD8a für eine Stunde bei vier Grad Celsius beschriften, anschließend eine Zentrifuge in frischem PBS waschen, um überschüssiges biotinyliertes Immunglobulin zu entfernen, dann die Proben mit einem geeigneten streptavidin-konjugierten Sekundärantikörper und einem geeigneten lebend-toten fixierbaren totzelligen Stamm für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zu färben und die Zellen auf einem Durchflusszytometer zu lesen, um die Spezifität und Anzahl der antigenspezifischen CD8+T-Zellen nach Standardprotokollen zu bestimmen. Hier wurde eine erfolgreiche Proteinkonjugation mit drei verschiedenen Methoden der Proteinbindung an Partikeln erreicht. Wenn die aAPC-Ligandendichte zu niedrig ist, wird es keine wirksame Stimulation der antigenspezifischen CD8+T-Zellen geben.
Die Qualitätskontrolle des biotinylierten Dimers kann auf transgenen CD8+T-Zellen zur Verifizierung der Färbung abgeschlossen werden. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen beispielsweise eine positive Färbung mit gp100-spezifischen CD8+T-Zellen mit nicht antigenspezifischen b6-CD8+T-Zellen als Hintergrundsteuerelement. Darüber hinaus ist die Kenntnis der Hintergrundfärbung des biotinylierten Dimers von entscheidender Bedeutung, da jeder Prozentsatz, der niedriger als diese Färbung in den cognate-gefärbten Röhrchen ist, als negatives Ergebnis angesehen werden sollte.
Nach sieben Tagen anreichern und ausdsetzen, zwischen zwei Mal 10 bis vier und zweimal 10 bis fünf bis fünf bis 50%CD8+T-Zellen können von einer ursprünglichen fünfmal 10 bis zur sechsten endogenen CD8+T-Zellanfangspopulation erwartet werden. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um menschliche antigenspezifische CD8+T-Zellen mit ähnlichen Prozentzuwächsen und Einer Anzahl antigenspezifischer CD8+T-Zellen zu isolieren und zu stimulieren, die nach nur einer Woche Expansion nach der Anreicherung beobachtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die entsprechenden Reagenzqualitätsprüfungen wie beschrieben durchzuführen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Durchflusszytometrie für intrazelluläre Zytokinfärbung oder oberflächenproteinexpression durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Funktionalität oder zum Phänotyp der Zellen zu beantworten. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher im Bereich der immunologischen Grundologie, um die Breite, Tiefe und Dynamik antigenspezifischer Reaktionen in anderen biomedizinischen Bereichen wie Krebs, Infektionskrankheiten oder Autoimmunitätsforschung zu erforschen.
