Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu beantworten, wie das Verständnis von Genexpressionsänderungen über Tausende von einzelnen Zellen nach einer Verletzung oder einer Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, Transkriptome einzelner Zellen innerhalb eines komplexen Gewebes zu sezieren und die funktionelle Dynamik innerhalb einer bestimmten Population besser zu schätzen. Der Vorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es umfassende Methoden bietet, von der Isolierung einzelner Zellen im Primärgewebe bis hin zur Analyse und Visualisierung dieses Datensatzes.
Obwohl diese Methode von einzelligen Suspensionen von der Haut und dem Nerv ausgeht, können die Sequenzierungsmethoden, die wir beschreiben, angewendet werden, um jedes Säugetiergewebe zu untersuchen. Demonstriert wird dieses Verfahren von Elodie Labit und Wisoo Shin, zwei Auszubildenden aus meinem Labor. Um zu beginnen, sezieren Sie den Ischiasnerv einer eingeschläferten Maus, indem Sie zuerst die Haut vom Hinterteil der Rückseite der Maus wegschneiden.
Verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um einen Schnitt entlang der Länge des Oberschenkels zu machen. Verwenden Sie dann feine Zangen und Scheren, um den Ischiasnerv zu belichten und zu entfernen. Um die dorsale Rückenhaut zu sezieren, verwenden Sie feine Zangen und Scheren, um Schnitte von Schulter zu Schulter, über den Rumpf und den Rücken hinunter zu machen.
Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem HBSS. Entfernen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop unerwünschtes Bindegewebe, Fettablagerungen oder Schmutz. Nur für die Haut, schneiden Sie die Haut in dünne Scheiben, mit einem sterilen SkalpellKlinge.
Um die Hautdermis zu erhalten, schweben die Hautscheiben in Dispase, in HBSS in einer 10-Zentimeter-Schale, für 30 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie feine Zangen, um die Epidermis zu schälen und von der Dermis zu trennen, und entsorgen Sie dann die Epidermis. Dann, für Haut und Nerven, verwenden Sie ein Paar sterile Skalpellklingen, um jede Probe in ein bis zwei Millimeter Stücke zerkleinern.
Legen Sie die Gewebestücke in frisch getunte, zwei Gramm pro Milliliter kalte Kollagennase-vier Enzym in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Jede Probe im Enzym in einem 37-Grad-Celsius-Bad 30 Minuten lang mit sanftem Schütteln alle 10 Minuten inkubieren. Nach 30 Minuten verwenden Sie einen P1000 Pipetter, um das Gewebe 20 bis 30 Mal zu trituieren und ins Wasserbad zurückzukehren.
Wiederholen Sie die Trituration alle 30 Minuten, bis die Lösung trüb erscheint und Gewebebrocken weitgehend voneinander getrennt sind. Nur für die Haut, in der letzten Stunde der Inkubation, fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter DNAse auf die Hautprobe. Da einige Zelltypen empfindlicher als andere auf mechanische Beanspruchung reagieren, können übermäßige Dissoziationstechniken Ihre Bevölkerung verzerrt.
Die allgemeine Dissoziation ist entscheidend für die Erreichung hoher Zellausbeute und eine genaue Darstellung der Gewebezusammensetzung. Danach verwenden Sie einen 40-Mikrometer-Filter auf der Oberseite des 50 Milliliter konischen Rohrs, um jede Gewebeprobe zweimal zu filtern. Spülen Sie den Filter mit einem Prozent BSA/HBSS.
Nach zentrifugieren der Proben, wie im Manuskript beschrieben, setzen Sie das Zellpellet in HBSS, das ein Prozent BSA enthält, mit einer Breitbohrspitze wieder auf, und legen Sie es auf Eis. Die Zugabe von Lebensfähigkeitfarbstoff wird Ihnen helfen, Ihre Vorbereitung zu optimieren. Sie sollten mindestens 80 Prozent lebensfähige Zellen anvisieren.
Einmal optimiert, können diese und andere Qualitätskontrollschritte weggelassen werden, um den Dissoziationsprozess zu beschleunigen, der die RNA-Qualität besser erhalten und den Zellverlust reduzieren wird. Um lebensfähige und gesunde Zellen mit FACS zu isolieren, bereiten Sie zunächst 15 Milliliter Schmalbodenröhren mit acht Millilitern eiskaltem BSA/HBSS für Probensammlungen vor. Um sicherzustellen, dass die Schnittstelle zwischen der Oberfläche der Flüssigkeit und der Innenseite des Rohres feucht ist, und um statische und Oberflächenspannung zu verhindern, invertieren Sie die Rohre vor den Sammlungen.
Unmittelbar nach der FACS-Zellsortierung, sobald Zellen in einem 15 Milliliter-Rohr gesammelt werden, verwenden Sie einen Milliliter von einem Prozent BSA/HBSS, um alle Zellen von der Seitenoberfläche des Rohres zu waschen und nach unten zu schieben. Dann Zentrifugieren Sie jede Probe bei 260 g für acht Minuten. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, setzen Sie das Zellpellet in einem Prozent BSA/HBSS wieder auf, und fügen Sie 33,8 Mikroliter zu einer Röhre hinzu, und halten Sie diese Röhre auf Eis.
Dieser Schritt ist für die Verwendung von Reagenzien aus einem standardisierten Kit konzipiert. Alle vorgezeigten Schritte sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Zur Vorbereitung auf die GEM-Generierung, legen Sie einen Chip in den Chiphalter, die bereiten Sie eine Zell-Master-Mix auf Eis, nach Herstellerprotokoll.
Fügen Sie 56,2 Mikroliter der Master-Mischung in ein Rohr mit 33,8 Mikroliter Selbstsuspension. Um den Chip vorzubereiten, zuerst bei 50 Prozent Glycerin zu den Brunnen, die nicht verwendet werden. Dann fügen Sie 90 Mikroliter der Zellmaster-Mischung zu gut ein, 40 Mikroliter Gelperlen zu gut zwei, und 270 Mikroliter Trennöl zu gut drei.
Bedecken Sie den Chip mit einer Dichtung. Um den Chip zu laden und in einem Einzelzellencontroller auszuführen, werfen Sie zuerst das Fach aus. Legen Sie den Chip in das Fach.
Ziehen Sie das Fach zurück, und drücken Sie die Wiedergabe. Nach dem vollständigen Lauf 100 Mikroliter der Probe sammeln und in ein PCR-Rohr legen. Platzieren Sie PCR-Rohre in einer voreingestellten PCR-Maschine und laufen Sie entsprechend dem Kit.
Im Anschluss an den Lauf werden GEMs in voller Länge, barcoded cDNA, aus polyadenylierter mRNA enthalten sein. Die Rohre über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aufstellen. Fahren Sie mit dem Erstellen, der Sequenzierung, Ausrichtung und Analyse der Bibliothek fort.
Sobald Proben sequenziert und ausgerichtet sind, wie im Manuskript beschrieben, hinterlegen Sie die Daten in einem öffentlichen Repository, wie z. B. NCBi es GEO. Registrieren Sie sich dazu für das Einsenderkonto. Schließen Sie zunächst die GEO-Übermittlung ab, indem Sie das Metadatenblatt herunterladen.
Stellen Sie sicher, dass Sie nur ein Metadatenblatt pro Projektübermittlung einschließen. Platzieren Sie die Kalkulationstabelle im Verzeichnis. Fügen Sie zweitens die Rohdatendatei hinzu, die aus dem Skript für die Anzahl der Zellen ranger für alle Bibliotheken generiert wurde, zum Verzeichnis.
Der dritte Ordner ist verarbeitete Datendateien. Platzieren Sie verarbeitete Datendateien, die aus dem Skript für die Anzahl der Zellen ranger für alle Bibliotheken generiert wurden, in das Verzeichnis. Verwenden Sie die FTP-Serveranmeldeinformationen des GEO-Absenders, um das Verzeichnis mit allen drei Komponenten zu übertragen.
Nach dem Ausführen von Cell Ranger können analysefähige Gen-Barcode-Matrizen mit fortschrittlicher Bioinformatik weiterverarbeitet werden. Zunächst wurden Vorverarbeitungsmengenprüfungen mit dem Seurat R-Paket durchgeführt, das Geigen- und Streudiagramme generierte, um die Anzahl der Gene, die Anzahl der eindeutigen molekularen Identifikatoren und den Prozentsatz der mitochondrialen Gene zu visualisieren, um Zelldoublets und Ausreißer zu identifizieren. Für die Auswahl von Hauptkomponenten oder PCs wurden Ellenbogendiagramme verwendet, bei denen PCs jenseits des Plateaus der Standardabweichung der PC-Achse ausgeschlossen wurden.
Die Auflösung des Clusterings wurde ebenfalls manipuliert. Niedrige Auflösung führte zu weniger Zellclustern, wobei jeder Cluster wahrscheinlich einen definierten Zelltyp darstellt. Hohe Auflösung führte zu einer höheren Zellwahrscheinlichkeit, die Untertypen oder Übergangszustände einer Zellpopulation darstellt.
Clustereinstellungen mit niedriger Auflösung wurden für die weitere Analyse von Expression-Heatmaps verwendet, um die am höchsten exprimierten Gene in einem bestimmten Cluster zu identifizieren. Einzelne Kandidatengene wurden auf tSNE-Plots visualisiert, mit Hilfe von Seustos Feature-Plot-Funktion, die die Entschlüsselung ermöglichte, ob es Cluster gab, die beispielsweise Makrophagen darstellten. Sowohl Cluster zwei als auch vier ausgedrückte CD68, ein Pan-Makrophagen-Marker.
Andere Pakete bieten auch Werkzeuge für die Qualitätskontrolle, z. B. Monocle, ein R-Paket, das zum Erstellen von Zellbahnen verwendet wird, entfernt Zellen von schlechter Qualität und stellt sicher, dass die Verteilung von mRNA auf alle Zellen log normal ist und zwischen oberen und unteren Grenzen fällt. Einzelne Zellen wurden dann klassifiziert und gezählt, unter Verwendung bekannter Linienmarkergene, und Zellen, die Marker von Interesse ausdrücken, wurden dem Zelltyp Nummer eins zugeordnet. Es wurde festgestellt, dass Zelltyp Nummer eins Fibroblasten waren.
Diese Population wurde bewertet, um Fibroblasten Entwicklungspfad zu bauen. Nach diesem Verfahren sollten andere Methoden wie quantitative PCR, In-situ-Hybridisierung, eine immunistische Chemie durchgeführt werden, um die Genauigkeit Ihrer Genexpressionsergebnisse zu validieren. Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat forschern in vielen verschiedenen Bereichen nun den Weg geebnet, um die Zell-zu-Zell-Heterogenität zu erforschen und die funktionelle Dynamik in verschiedenen Geweben während der Homöostase zu identifizieren und wie sich diese nach Einer Verletzung oder bei der Entwicklung von Krankheiten ändern können.
