Um einen mikrogliaalen Phänotyp vollständig zu charakterisieren, ist es wichtig, sowohl die basale als auch die richtungsweisende Motilität anzusprechen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Richtungsbeweglichkeit von Mikroglia durch Zwei-Photonen-Bildgebung in Mäuse-Gehirnscheiben zu testen, mit maßgeschneiderten 3D-Druck-Schnittstelle und Perfusionskammern. Das Verfahren wird Fanny Etienne, eine Doktorandin, und Vincenzo Mastriolia, ein Postdoktorand, beide aus unseren Laboratorien demonstrieren.
Mindestens 30 Minuten vor der Zerlegung, beginnen sprudeln 70 Milliliter Cholin künstliche Zerebrospinalflüssigkeit, oder Cholin aCSF, auf Eis. Fügen Sie 150 Milliliter Cholin aCSF bei 32 Grad Celsius, mit Carbogen. Legen Sie eine 200 Milliliter Kristallisationsschale mit einem Stabmagneten in eine versiegelte Futterbox und fügen Sie 200 Milliliter ACSF in die Schale.
Legen Sie einen 3D-gedruckten Interface-Scheibenhalter auf die Schale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der kristallisierenden Schale, bis nur noch ein dünner Lösungsfilm verbleibt, der das Netz des Interface-Diahalters abdeckt. Fügen Sie ein paar Millimeter aCSF an der Unterseite der Food-Box und beginnen, die Flüssigkeit mit Autobogen zu sprudeln. Schließen Sie dann die versiegelte Box, während Sie eine konstante Karbogenation beibehalten, um eine befeuchtete, 95%Sauerstoff, 5% Kohlendioxid-reiche Grenzkammer zu erzeugen.
Legen Sie das Gehirn nach der Ernte auf ein Stück mit CSF-getränktem Filterpapier und sezieren Sie den Interessenbereich entsprechend dem bevorzugten Schnittwinkel. Für koronare Scheiben positionieren und kleben Sie das kaudale Gesicht des Gehirns auf eine 10 Zentimeter lange Petrischale, die am Schneidblock eines vibrierenden Schneideschneiders befestigt ist, und positionieren Sie den Block in der Reservoirkammer des vibrierenden Schneidschneiders in einer großen, mit Eis gefüllten Kammer. Füllen Sie die Schale mit eiskaltem Cholin aCSF und verwenden Sie den Slicer, um 300 Mikrometer dicke Gehirnscheiben zu erhalten, wobei Sie eine Einweg-Übertragungspipette mit einem Durchmesser von vier Millimetern nach jedem Durchgang der Klinge verwenden, um jede Scheibe zu sammeln.
Lassen Sie jede Scheibe in der 32 Grad Celsius Cholin aCSF für etwa 10 Minuten erholen, nachdem es erhalten wurde, bevor Sie die Scheiben auf Stücke von Linsenreinigungspapier übertragen, mit einem Tropfen Cholin aCSF gekrönt. Dann aspirieren Sie das überschüssige Cholin aCSF und verwenden Sie einen Spachtel, um die Scheiben auf das Netz der Schnittstellenkammer zu übertragen, so dass die Scheiben in dieser Umgebung für mindestens 30 Minuten erholen können. 30 Minuten vor Beginn der Aufnahme die peristaltische Pumpe an eine kundenspezifische Aufnahmekammer mit Ober- und Unterperfusion anschließen, um die Sauerstoffversorgung und Lebensfähigkeit der Gewebescheiben zu optimieren, und reinigen Sie das gesamte Perfusionssystem mit 50 Milliliterr Reinstwasser.
Beginnen Sie am Ende des Reinigungszyklus die Durchblutung der Aufnahmekammer mit 50 Millilitern aCSF in einem Glasbecher unter ständiger Karbogenation, und verwenden Sie eine Einweg-Breitmaul-Transferpipette, um die erste zu bebilderte Scheibe in das Becherglas zu übertragen, um das Linsenpapier zu entfernen. Wenn der Abschnitt auf den Boden des Bechers gesunken ist, übertragen Sie den Abschnitt in die Aufnahmekammer und positionieren Sie den Scheibenhalter auf die Scheibe, um die durch den Durchfluss induzierte Bewegung zu minimieren. Verwenden Sie hellfeldbezogene Beleuchtung, um die von Interesse befindliche Hirnregion unter einer fünf- bis zehnfachen Vergrößerung anzusprechen.
Verwenden Sie dann ein 25-faches Objektiv mit einer 0,35-fachen Wasser-Tauchlinse, um die Position des Sichtfeldes anzupassen. Verwenden Sie Fluoreszenzbeleuchtung, um die fluoreszierenden Mikrogliazellen zu lokalisieren und die Pipette mit 10 Mikrolitern aCSF zu füllen, die die Verbindung von Interesse in ihrer endgültigen Konzentration enthalten. Zeigen Sie die Spitze mit sanftem Schütteln nach unten, um alle in der Spitze eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen, und montieren Sie die gefüllte Pipette in einen Pipettenhalter, der mit einer Fünf-Milliliter-Spritze verbunden ist, wobei der Kolben an der Fünf-Milliliter-Position positioniert und auf einem dreiachsigen Mikromanipulator montiert ist.
Senken Sie die Pipette sanft in Richtung der Scheibe, steuern und passen Sie das Objektiv zur gleichen Zeit, bis die Pipette Spitze leicht berührt die Oberfläche der Scheibe. Stimmen Sie nun den Laser ab und schalten Sie das Mikroskop in den Multiphotonenmodus. Stellen Sie sicher, dass die Kammer von jeder Lichtquelle abgeschirmt wird, und schalten Sie die nicht gescannten Detektoren ein.
Legen Sie die Verstärkung fest, und verwenden Sie eine Nachsuchtabelle mit einer farbcodierten Obergrenze, um zu vermeiden, dass die Pixel im Bild gesättigt werden. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme für eine Gesamtdauer von mindestens 30 Minuten, indem Sie den Spritzenkolben nach fünf Minuten über einen Zeitraum von fünf Sekunden langsam von der Fünf-Milliliter-Position deprimieren, um die Verbindung auf den Abschnitt aufzutragen. Für die Bildanalyse führen Sie zunächst z-Projektion und Driftkorrektur mit ImageJ in der Interessensdatei durch.
Öffnen Sie dann die geänderte Datei in Eis und zeichnen Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 35 Mikrometern, der über der Injektionsstelle zentriert ist. Führen Sie den Film erneut mit dem ROI aus, um sicherzustellen, dass er gut positioniert ist. Verwenden Sie dann das Bereich der Interessenintensität Evolution Plugin, um die mittlere Intensität im Laufe der Zeit in der Region von Interesse zu messen, und speichern Sie die Ergebnisse als xls-Datei.
Dieses Protokoll ermöglicht es, die Reaktionen, die durch verschiedene Verbindungen induziert werden, wie ATP oder Serotonin, zu messen. Obwohl die Injektion von ATP eine Erhöhung der Fluoreszenz hervorruft, gibt es nach den meisten ATP-Injektionen eine sofortige, leichte Abnahme der Fluoreszenz aufgrund von Gewebeverzerrungen, die nach einigen Minuten zurückkommen. Die Größe des Interessenbereichs wirkt sich auch auf die Quantifizierung aus, da die Erhöhung des Durchmessers die Variabilität zwischen den Experimenten verringert, aber die Genauigkeit und Größe der erkannten Reaktion verringert.
Die Beurteilung der mikroglialen Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt kann für den statistischen Vergleich verschiedener Verbindungen oder für die Untersuchung der Wirkungen spezifischer Antagonisten, die der Perfusionslösung zugesetzt werden, nützlich sein. Um die Beweglichkeit in drei Dimensionen zu quantifizieren, müssen Sie möglicherweise das Z-Schritt-Intervall und die Abtastrate der Erfassung ändern, um in die Analyseanforderungen zu passen.
