Hier zeigen wir, wie der ATP-empfindliche FRET-Sensor ATeam 1.03 YEMK für dynamische Messungen von Veränderungen des neuronalen und astrozytatischen ATP-Spiegels in organotypisch kultivierten Maus-Hippocampus-Scheiben verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man den Energiestoffwechsel im lebenden Hirngewebe in einer kontrollierten Umgebung untersuchen kann, einer Umgebung mit hohen Sensorexpressionsniveaus. Diese Technik kann helfen, Einblicke in Pathomechanismen, zugrunde liegende Krankheiten oder Hirnschäden zu gewinnen, zum Beispiel durch Energieentzug, wie ischämischen Schlaganfall.
Es kann im Prinzip verwendet werden, um ATP-Spiegel zu studieren, nicht nur im Gehirngewebe, sondern auch in anderen Organen. Um dieses Experiment erfolgreich durchzuführen, ist es wichtig, alle Schritte durchzuführen, die bei der Kultivierung des Gewebes extrem sorgfältig und steril itätserhalten sind. Darüber hinaus sind einige Kenntnisse der zellulären fluoreszierenden Bildgebung erforderlich.
Die Gewebehandhabung in einem ausgefeiltesten Ansatz und einer Visualisierung ist entscheidend, um die richtigen Verfahren zu verstehen. Dasselbe gilt für bildgebende Experimente. Demonstriert wird das Verfahren von Rodrigo Lerchundi, einem Postdoc, und Na Huang, einem Master-Studenten aus dem Labor.
In einer eiskalten Petrischale, gefüllt mit ACSF, legen Sie das Gehirn auf eine Filtermembran. Trennen Sie die Hemisphären und führen Sie einen parasagittalen Schnitt in einem Winkel von 45 Grad durch. Fixieren Sie eine Hemisphäre im Vibratome-Gewebestadium mit Superkleber und übertragen Sie den Gewebeblock sofort in das Vibratome-Bad, das eiskalte ACSF enthält, die mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff sprudelt.
Richten Sie das Gewebe im Vibratome-Bad aus. Halten Sie die zweite Hemisphäre in eiskaltem ACSF bis zum Schneiden. Passen Sie das Vibratome an, um Scheiben mit 250 bis 400 Mikrometern zu schneiden.
Nach dem Schneiden der Scheibe, identifizieren Sie die Hippocampus-Bildung auf der Grundlage ihrer typischen morphologischen Aussehen und isolieren Sie es mit hypodermischen Nadeln, wobei der Teil der Großhirnrinde neben dem Hippocampus zu halten. Legen Sie die Scheibe auf ein Netz in ACSF, erwärmt auf 34 Grad Celsius und sprudeln mit 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff, bis alle Scheiben gesammelt werden. Übertragen Sie die Scheiben in den laminaren Strömungsschrank, um unter sterilen Bedingungen fortzufahren.
Mit einer invertierten, sterilen Pasteur-Pipette aus Glas die Scheiben aus dem ACSF vorsichtig in eine der vorgewärmten Petrischalen mit steriler Hanks'Salz-Lösung übertragen. Wechseln Sie die Pipette und übertragen Sie die Scheiben auf das zweite Kulturgericht. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt fünfmal.
Übertragen Sie so wenig HBSS wie möglich auf die folgenden Kulturplatten. Mit einer Pipette eine Scheibe nach der anderen vorsichtig auf die Oberseite des Kultureinsatzes legen. Vermeiden Sie Turbulenzen in der Pipette und warten Sie, bis die Scheibe zur Spitze der Pasteur-Pipette absteigt.
Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Slice. Legen Sie zwei Scheiben auf eine Membran. Entfernen Sie sorgfältig überschüssige Hank-Lösung von der Oberseite des Einsatzes mit einer feinen Spitze.
Halten Sie die Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius bis zum Tag des Experiments. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Ohne das Gewebe zu berühren, tragen Sie 0,5 Mikroliter des verdünnten Vektors direkt auf die Oberseite jeder Scheibe auf.
Schließlich die Scheiben wieder in den Brutkasten legen und dort noch mindestens sechs Tage pflegen. Kurz vor Beginn eines Experiments einen Einsatz mit kultivierten Scheiben in die sterile Kapuze geben und in eine 30-Millimeter-Schale mit einem Milliliter organotypischen Scheibenkulturmedium oder minimalem essentiellen Medium legen. Legen Sie die Schale unter das Stereoskop und konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Scheibe.
Verwenden Sie zwei sterile hypodermische Nadeln, um einen kurzen Querschnitt direkt an den schmalen Rändern einer ausgewählten Scheibe und in der oberen Schicht zu machen, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen. Um die vorbereitete Scheibe aus dem Einsatz zu entfernen, halten Sie die Ränder der Membran mit einer Pinzette und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um gerade, parallele Schnitte zur Membran zu machen, die ein Quadrat oder ein Dreieck mit der Scheibe in der Mitte bilden. Wenn der Einsatz zusätzliche Scheiben enthält, übertragen Sie ihn zurück auf die Originalplatte und in den Inkubator.
Die Oberflächenspannung des Mediums verhindert, dass es auf die Oberfläche der Membran austritt. Bereiten Sie experimentelle ACSF vor und erhalten Sie einen pH-Wert von 7,4, indem Sie sie mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durch einen eingelegten Schlauch, der mit der Carbogen-Versorgung verbunden ist, für mindestens dreißig Minuten sprudeln. Halten Sie die Saline während des gesamten Experiments blasen.
Schalten Sie dann die Fluoreszenzlichtquelle des Monochrometers ein. Übertragen Sie die organotypische Scheibenkultur in die Versuchskammer. Legen Sie ein Gitter über die organotypische Schnittkultur mit dem Rahmen nach unten, berühren Sie nicht die Kultur, und die Fäden nach oben, berühren Sie die Membran.
Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und schließen Sie sie an das Perfusionssystem an. Schalten Sie die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von 1,5 bis 2,5 Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem nicht austritt.
Mit Demontierungslicht die kultivierte Scheibe in den Fokus rücken und den Bereich identifizieren, in dem Experimente durchgeführt werden sollen. Bevor Sie mit Bildgebungsexperimenten beginnen, warten Sie mindestens 15 Minuten, damit sich die Scheiben an die salinebedingungen anpassen können, und schalten Sie dann die Kamera und die Bildverarbeitungssoftware ein. Erregen Sie den Spender fluoreszierendes Protein mit 435 Nanometern.
Stellen Sie die Belichtungszeit auf 40 bis 90 Millisekunden ein. Legen Sie dann den dichroitischen Spiegel und die Filter in die Strahlsplittereinheit ein. Teilen Sie die Fluoreszenzemission mit einem Emissionsbildteiler auf 500 Nanometer und verwenden Sie Bandpassfilter bei 482 plus oder minus 16 und 542 plus oder minus 13,5 Nanometern, um die Fluoreszenz von Spendern und Akzeptoren weiter zu isolieren.
Wählen Sie eine Region von Interesse scheinbar frei von zellulärer Fluoreszenz für Hintergrundsubtraktion. Kreisen Sie einzelne Strukturen von beschrifteten Geweben im Bild auf dem Bildschirm ein, um ROIs zu erstellen. Legen Sie die Häufigkeit der Bildaufnahme und die Gesamtaufnahmezeit fest.
Für Experimente mit einer Zeit von mehr als 30 Minuten wird eine Erfassungshäufigkeit von 0,2 bis 0,5 Hertz empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern. Starten Sie anschließend die Aufzeichnung. Um Veränderungen im intrazellulären ATP zu induzieren, schalten Sie das Perfusionsrohr von Standard-ACSF auf eine Saline mit metabolischen Inhibitoren, z. B. chemische Ischämielösung.
Alternativ können Sie eine Saline mit erhöhter Kaliumkonzentration bei acht Millimolar verwenden, um die Freisetzung von Kaliumionen aus aktiven Neuronen nachzuahmen. Tauschen Sie direkt nach den Aufnahmen den experimentellen ACSF mit heaps-gepufferten ACSF aus. Übertragen Sie dann die Aufnahmekammer mit der Scheibenkultur auf das konfokale Laserscanmikroskop.
Nehmen Sie Z-Stack-Bilder mit der höchsten Z-Auflösung bei der angegebenen optischen Konfiguration auf. In diesem Protokoll wurden zehn Tage nach einer Transduktion Neuronen, die ATeam 1.03 YEMK exdrücken, mit hoher Dichte im Neocortex kultivierter Gewebescheiben in Tiefen von bis zu 50 Mikrometern unter der Schnittfläche gefunden. Vergleichbare Ergebnisse wurden im Hippocampus erzielt.
Für Astrozyten wurde ATeam 1.03 YEMK unter der Kontrolle des menschlichen glialen fibrolarigen sauren Proteinpromotors exprimiert, und organotypische Scheiben, die ATeam 1.03 YEMK in den Hippocampus-Neuronen exprimieren, stellen ausgewählte ROIs die Somata von Pyramidenzellen dar. Nachdem die Scheibe in Ermangelung von extrazellulärer Glukose für eine Minute 5 Millimolar-Natriumazid ausgelegt wurde, wurden entgegengesetzte Veränderungen in der Emissionsintensität des FRET-Paares induziert. Ein reversibler Rückgang des ATeam FRET-Verhältnisses wurde ebenfalls beobachtet.
Das langfristige ATeam FRET-Verhältnis in 14 verschiedenen Zellen unter Basisbedingungen in Neuronen und Astrozyten zeigt, dass das ATeam ein zuverlässiger und stabiler Sensor ist. Bitte beachten Sie, dass die chemische Ischämie am Ende dieses Experiments zu einem erwarteten starken Rückgang des ATeam-Verhältnisses bei beiden Zelltypen geführt hat. Eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration von drei auf acht Millimolar für drei Minuten brachte keine nachweisbare Veränderung der Neuronen, die ATeam 1.03 YEMK exdrückten.
Im Gegensatz dazu reagierten Die Astrozyten auf den Anstieg des extrazellulären Kaliums mit einem reversiblen Anstieg des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf einen Anstieg der intrazellulären ATP-Spiegel hindeutet. Auch hier führte die chemische Ischämie zu einer sofortigen Abnahme des ATeam-Verhältnisses, was zeigt, dass der Sensor Veränderungen in ATP erkennen kann. Beim Versuch der FRET-basierten zellulären Bildgebung, wie hier beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass die Herstellung von hochwertigen Scheiben in organotypischen Kulturen ein wichtiger Schritt ist.
Darüber hinaus sind eine sorgfältige Entfernung der Glianarbe und eine Bildgebung auf Expertenebene erforderlich. Nach diesem Verfahren sollte man auch in der Lage sein, Experimente mit verschiedenen anderen FRET-basierten Nanosensoren für zelluläre Metaboliten durchzuführen. Zum Beispiel, diejenigen für Glukose oder Laktat.
Nicht zuletzt muss betont werden, dass relevante Tierschutzmaßnahmen stets beachtet werden müssen. Dies gilt auch für die wirksamen Gesetze über den Umgang mit genetisch veränderten Organismen.
