Ziel unserer Forschung ist es, die Pathogenese der Multiplen Sklerose zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir ein schnelles Autopsieprogramm eingerichtet, um die Gehirne von Personen mit MS zu erhalten und zu studieren. Es gibt zwei spezielle Aspekte unseres Autopsieprogramms, der erste ist, dass es schnell ist. Wir sammeln die Gehirne unter sechs bis acht Stunden des Todes.
Dies ermöglicht molekulare Studien auf dem Stand der Technik. Der zweite Aspekt ist, dass wir eine in situ MRT machen, bevor wir das Gehirn bewegen. Dies ermöglicht es uns, pathologische Veränderungen mit Veränderungen der Hirnbildgebung zu korrelieren.
Visuelle Demonstration ermöglicht es den Zuschauern zu verstehen, wie wir unseren Raum und unsere Zeit organisieren, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die schnell und sorgfältig eingeuge Gewebeverarbeitung ermöglicht RNA-Analysen, Immunflecken, Immunoblotting und MRT-Korrelationen. Neue Forscher können mit der Verarbeitung von Geweben mit schlechter Gewebeintegrität zu kämpfen haben.
Die Vermeidung langer Post-Mortem-Fixierungszeiten ist wichtig und MRT-Gewebeschnur-Sttriationen können eine Herausforderung sein, so dass die Konsultation mit MRT-Analyseexperten sehr nützlich sein kann. Das Verfahren wird Emilie Christie und Christina Volsko demonstrieren. Techniker aus unserem Labor.
Nach der In-situ-Magnetresonanztomographie wiegen und fotografieren Sie das Gehirn und legen Sie jede angeschlossene Dura in einen Behälter mit 4% Paraformaldehyd oder PFA. Trennen Sie Kleinhirn und Hirnstamm vom Großhirn und fotografieren Sie das Großhirn. Verwenden Sie eine Sonde, um die Sehnerven, Chiasm und Traktate zu trennen und die Struktur mit einem Skalpell zu resektieren.
Trennen Sie die Zerebralparese längs und fotografieren Sie jede Hemisphäre einzeln. Tinte der primären motorischen Kortex oder PMC für die linke Hemisphäre, rephotographieren Sie das Gewebe und legen Sie das Gewebe in einem 3,3-Liter-Behälter für lange Fixierung. Um die PMC für die rechte Hemisphäre zu verbrauchen, entfernen Sie die Abdeckungsmenings und fotografieren Sie das Gewebe neu.
Als nächstes resektdie PMC mit einem Skalpell. Dann fotografieren Sie die resected PMC neben der Hemisphäre. Schneiden Sie die PMC in sechs gleich große Abschnitte und Tinte der rostralen Aspekt jedes Abschnitts.
Legen Sie dann jeden zweiten Abschnitt in PFA-gefüllte Behälter für kurze Fixierung. Und schnappen Sie die restlichen Abschnitte für die Lagerung in versiegelten Gefrierbeuteln, in Kühler Nummer eins. Schneiden Sie die rechte Halbkugel nachaußen in einen Zentimeter dicken koronalen Abschnitten.
Befestigen Sie jeden zweiten Abschnitt in PFA und fangen Sie die restlichen Abschnitte für die Lagerung in versiegelten Gefrierbeuteln, in Kühler Nummer eins, einzufrieren. Trennen Sie das Hirnstamm vom Kleinhirn und legen Sie den Hirnstamm zur kurzen Fixierung in einen PFA-gefüllten Behälter. Schneiden Sie jede Kleinhirnhalbkugel in vier gleich feste sagittale Abschnitte und fotografieren Sie die medialen und seitlichen Ansichten.
Dann legen Sie die linken Kleinhirn-Hemisphärischen Scheiben in einen Behälter mit PFA für kurze Fixierung. Und schnappen Sie die richtigen Kleinhirn-Hemisphärischen Scheiben für die Lagerung in versiegelten Gefrierbeuteln, in kühlere Nummer eins. Nach Erhalt des Rückenmarks mit den Nervenwurzeln entfernen Sie das Rückenmark dura mater und speichern Sie die Dura in PFA.
Trennen Sie die linken und rechten vorderen und hinteren Nervenwurzeln und schneiden Sie die linken vorderen und hinteren Nervenwurzeln aus dem Rückenmark für eine kurze Fixierung in PFA. Schneiden Sie die rechten vorderen und hinteren Nervenwurzeln aus dem Spinalakkord und schnappen Sie diese Gewebe für die Lagerung in versiegelten Gefrierbeuteln, in Kühler Nummer zwei. Dann fotografieren Sie die kaudalsten 20 Zentimeter des Rückenmarks und schneiden Sie zwei Zentimeter Transferabschnitte von der kaudalen in rostrale Richtung der Schnur für PFA kurze Fixierung und Snap Freezing.
Dann fotografieren Sie den restlichen rostralen Teil des Rückenmarks. Und schneiden Sie zwei Zentimeter Transferabschnitte von der kaudalen zur rostralen Richtung der Schnur für PFA kurze Fixierung und Snap Freezing. Abschnitte von Interesse aus dem kurzen oder langen festen Gewebe schneiden.
Legen Sie die Abschnitte in einzelne Brunnen einer sechs Brunnenplatte und waschen Sie das Gewebe mit drei fünfminütigen Wäschen in zwei Milliliter frische PBS pro Wäsche, mit Schütteln. Für Antigen-Retrieval, Mikrowelle die Abschnitte für zwei bis drei Minuten in einem Glasbecher mit etwa 30 Milliliter 10 Millimollar CitratPuffer. Wenn die Abschnitte auf Raumtemperatur abgekühlt sind, übertragen Sie die Proben in eine neue sechs Brunnenplatte für drei fünfminütige Wäschen und zwei Milliliter PBS, plus 0,3% Triton X-100 pro Brunnen, pro Waschgang.
Gefolgt von endogener Peroxidase-Blockierung in zwei Millilitern 3%Wasserstoffperoxid plus 0,3%Triton X-100 in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte am Ende der Inkubation dreimal in zwei Milliliter PBS plus Triton X-100 pro Waschgang, wie gezeigt. Gefolgt von der Blockierung in zwei Milliliter von 3%normaler Ziege Serum und PBS plus Triton X-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte von über Nacht auf fünf Tage in den primären Antikörpern von Interesse bei vier Grad Celsius gefolgt von drei fünfminütigen Wäschen in zwei Milliliter PBS pro Wäsche. Inkubieren Sie die Abschnitte in avidin-biotin komplexe Lösung oder ABC-Komplex für eine Stunde, bei Raumtemperatur. Folgen Sie diesem Mit drei fünfminütigen Wähungen in PBS.
Beschriften Sie die Abschnitte mit zwei Millilitergefiltertem Diaminobenzidin, ergänzt mit Wasserstoffperoxid pro Brunnen für drei bis acht Minuten. Wenn sich die Farbe ausreichend entwickelt hat, waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS und übertragen Sie jeden Abschnitt einzeln in einen PBS-gefüllten Behälter. Positionieren Sie jeden Abschnitt flach unter einzelnen Geweberutschen.
Und heben Sie vorsichtig jede Rutsche aus dem PBS, so dass die Abschnitte so flach wie möglich zu halten. Verwenden Sie zwei Pinsel, um jedes Gewebe sanft abzuflachen und zu dehnen. Und verwenden Sie ein Papiertuch, um das überschüssige Wasser wegzureißen.
Dann montieren Sie die Abschnitte mit einem geeigneten Montagemedium und versiegeln Sie jeden Deckelschlupf mit klarem Nagellack. Gewebeabschnitte werden auf das Vorhandensein von Läsionen weißer Materie untersucht und die ausgewählten Regionen sind auf Immunaktivität und Demyelination gefärbt. Bei akuten Multiple Sceloris Läsionen wirken viele dieser demyelinierten Axone als axonale Rückzugszwiebeln, die die proximalen Enden von transektierten Axonen widerspiegeln.
Die Dichte der transectierten Axone bei akuten Läsionen überschreitet 11000 pro Kubikmillimeter bei aktiven Läsionen im Vergleich zu nur 15 in benachbarten nicht-lesionalen Weißen Materieregionen. Neu erzeugte Oligodendrozyten sind auch in vielen chronischen MS-Läsionen vorhanden. Diese Prozesse verbinden sich mit aber nicht myeliatent endeutinierten Axonen.
Eine repräsentative, unvoreingenommene Suche nach neuronalen Genveränderungen im schnell eingefrorenen motorischen Kortext, die von chronischen MS-Patienten gewonnen wurden, identifizierte signifikante Reduktionen von 23 nuklearen und kodierten mitochondrialen Boten-RNA-Anmeldestudien mit Immunzytochemie und In-situ-Hybridisierung zeigte, dass diese Gene in kortikalen Projektionsneuronen hoch angereichert waren und dass mitochondriene, aus Projektionsaxons isolierte Mitochondrien eine reduzierte Glykolyse aufweisen. Der Vergleich der neuronononischen Genexpression in myelinierten und demyelinierten Hippocampi zeigt eine Verringerung der neuronalen Boten-RNA, einschließlich Proteinen, die am Gedächtnis und Lernen beteiligt sind. Darüber hinaus ist der kortikale neuronale Verlust im Vergleich zu Kontrollkortika bei einer Subpopulation von MS-Patienten, die eine Demyelination des Rückenmarks und des zerebralen Kortextes haben, aber nicht der zerebralen weißen Substanz, signifikant größer.
Stellen Sie bei der Gewebeverarbeitung sicher, dass die koronalen Abschnitte beim Schneiden in Bezug auf Dicke und Ausrichtung konsistent geschnitten werden. Und dass sie flach liegen, wenn sie in einem Fixativ schweben oder wenn gefroren. Neben der immunhistochemischen Analyse bietet uns die gefrorene Gewebesammlung die Möglichkeit, genetische und proteomische Analysen durchzuführen.
Diese Techniken haben bei der Identifizierung einer neuen Kohorte von MS-Patienten mit zerebralen weißen Materieläsionen auf MRT, aber ohne signifikante weiße Materie Demyelination unterstützt. Als myelocortical MS bezeichnet.
