Dieses Protokoll ist wichtig für die Bestimmung der glykolytischen Funktion und der mitochondrialen Atmung bei Candida albicans. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es ermöglicht, die mitochondriale Funktion zu messen, ohne die Notwendigkeit, Mitochondrien von Candida albicans zu reinigen. Diese Methode kann optimiert werden, um die Auswirkungen von genetischer Manipulation oder chemischen Modulatoren auf mitochondriale und glykolytische Wege bei Candida Albicans oder anderen Pilzerregern zu untersuchen.
Diese Technik ist relativ einfach. Oder je nach Organismus, ihre Verwendung kann helfen, die Zellzahl und die Konzentration von mitochondrialen Inhibitoren in ihrem Assay zu optimieren. In einer laminaren Strömungshaube poly-D-Lysin in Gewebegitterwasser auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter auflösen.
Mischen Sie die Lösung gut und aliquot es in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre, die sicherstellen, dass mindestens 1,3 Milliliter pro Tube aliquotieren. 50 Mikroliter dieser Mischung in jeden Brunnen der Assayplatte geben, den Deckel bedecken und bei Raumtemperatur ein bis zwei Stunden brüten. Dann die Lösung ansaugen.
Spülen Sie die Brunnen der Assayplatte einmal mit 500 Mikroliter sterilem Gewebekultur-Grade-Wasser, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Brunnen trocknen. Wenn Sie die Platte nicht am Tag der Präparat verwenden, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius für maximal zwei bis drei Tage. Öffnen Sie am Tag vor dem Experiment das zusätzliche Fluss-Assay-Kit und entfernen Sie den Inhalt.
Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Gebrauchsschild. Füllen Sie jeden Brunnen der Gebrauchsplatte mit einem Milliliter Kalibrant und legen Sie dann die Sensorpatrone wieder auf. Stellen Sie sicher, dass die Sensoren, die Fluorophore enthalten, in das Kalibrant eingetaucht sind.
Inkubieren Sie die Sensorpatrone über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Am Tag vor dem Test impfen Sie die vorbereiteten C-Albicans in der YPD-Brühe und wachsen über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem Shaker bei 200 U/min. Am Tag des Assays eine angemessene Anzahl von Zellen im Testmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro 100 Mikroliter zu ergeben.
Fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Zellen in jeden Brunnen der Assayplatte mit Ausnahme der Brunnen A1, B4, C3 und D6 hinzu. Zu diesen Brunnen, fügen Sie nur 100 Mikroliter Assay-Medium für Hintergrundkorrektur. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator für 60 Minuten, damit die Zellen an der Plattenoberfläche haften. Bereiten Sie die Verbindungen für den mitochondrialen Funktionstest mit 10-facher Konzentration im entsprechenden Assaymedium vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Fügen Sie 50 Mikroliter SHAM in Port A, 50 Mikroliter Oligomycin in Port B, 62 Mikroliter Kaliumcyanid in Port C und 68 Mikroliter Antimycin A in Port D.Next, bereiten Sie die Verbindungen für den glykolytischen Stresstest bei 10-facher Konzentration im entsprechenden Assaymedium vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 50 Mikroliter Glukose in Port A, 55 Mikroliter Oligomycin in Port B, 62 Mikroliter 2-DG in Port C und 68 Mikroliter Antimycin A in Port D.Vor dem Test, öffnen Sie den zusätzlichen Flussanalysator und richten Sie die Assay-Vorlage mithilfe der Registerkarte Assay-Assistent ein. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Anleitung und füllen Sie alle Informationen aus, die während des Setups angezeigt werden.
Generieren Sie ein Gruppenlayout, und richten Sie das Protokoll wie im Textprotokoll beschrieben ein. Speichern Sie diese Layouts vor dem Test. Stellen Sie zum Zeitpunkt des Assays das gespeicherte Protokoll wieder her, indem Sie die entsprechende Datei in der Option "Geöffnete Datei" auf der Registerkarte Assay-Assistent öffnen.
Dann laden Sie die 10X Verbindungen in die entsprechenden Anschlüsse der hydratisierten Sensorpatrone, die das Kalibrant enthält. Laden Sie die Sensorpatrone in das Trägerfach des zusätzlichen Flussanalysators. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie auf die Starttaste auf dem Bildschirm klicken.
Als nächstes fügen Sie 350 Mikroliter des Assaymediums vorsichtig auf die Zellplatte an der Seite der Wände, um Zellstörungen zu minimieren, wodurch das endige Volumen auf 450 Mikroliter ankommt. Ersetzen Sie die Gebrauchsplatte, die das Kalibrant enthält, durch die Assayplatte und setzen Sie den Assay fort. Sobald der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie die Sensorpatrone und die Platte.
Speichern Sie die Datei im entsprechenden Zielordner. In dieser Studie werden die bioenergetischen Funktionen der C-Albicans durch einen zusätzlichen Flussanalysator bewertet. Ein Mutant, dem das mitochondriale Protein mam33 fehlt, ist ebenfalls enthalten, zusammen mit seinem Komplementstamm, um die Auswirkungen der Deletion eines mitochondrialen Proteins auf die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazellulären Versauerungsraten zu untersuchen.
Der C albicans Wildtyp zeigt eine Sauerstoffverbrauchsrate von 145 Picomolen pro Minute, die gut im optimalen Bereich für jeden extrazellulären Flusstest liegt. Die Basalsauerstoffverbrauchsrate der Wildart, mam33 mutiert und mam33 ergänzte Stämme zeigen keine Unterschiede. In ähnlicher Weise sind keine signifikanten Unterschiede in den basalen extrazellulären Versauerungsraten zwischen den Stämmen zu beobachten.
Durch die Hemmung von Komplex-IV mit Kaliumcyanid, dem Wildtyp und mam33-Mutanten zeigen mam33-Ergänzungsstämme jedoch eine signifikante Verschiebung in Richtung Der Glykolyse. Der mam33 mutierte Stamm zeigte jedoch keine kompensatorische glykolytische Verschiebung, die darauf hindeutet, dass der verbindungs-IV-abhängige Weg in diesem Stamm beeinträchtigt ist. Im glykolytischen Stresstest werden die Zellen eine Stunde lang an Glukose verhungert und die Basalsauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate gemessen.
Nach dem Hungertod zeigt der mam33 mutierte Stamm deutlich niedrigere Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Versauerungsraten im Vergleich zu den anderen Stämmen. Dies deutet auf eine beeinträchtigte Verwendung von Glukose für Atmung und Glykolyse hin, wenn Zellen zum Hungerzustand gezwungen werden. Nach der Injektion von Glukose zeigen alle Stämme eine Stimulation sowohl ihrer Sauerstoffverbrauchsrate als auch ihrer extrazellulären Versauerungsrate.
Die Beschichtung der Assayplatte ermöglicht Candida albicans Zellen, auf der Platte zu haften. Unsachgemäße Haftung von Candida albicans Zellen wird das Assay-Ergebnis beeinflussen. Nach der Entwicklung dieser Technik, Es wurde in einer Breitenpalette von Zelltypen und Krankheiten verwendet, die sich damit befassen, wie Mitochondrien unter physiologischen und pathologischen Bedingungen funktionieren.
Beispielsweise ist es unter Verwendung von patientenabgeleiteten und Kontrollzellen in diesem Test möglich, die spezifischen Fragen zu beantworten, wie die mitochondriale Funktion verändert wird. Bei der Herstellung von mitochondrialen Inhibitoren wie Kaliumcyanid und Antimycin A ist Vorsicht geboten, da diese Verbindungen extrem giftig sind.
